CHƯƠNG 3 : KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. PHÂN LẬP GEN ZmBZIP72 TỪ CÂY NGÔ
3.1.4. Tạo dòng gen ZmbZIP72 trong vector pJET1.2
Nhằm mục đích tạo dòng và xác định trình tự nucleotide đoạn gen, chúng tôi tiến hành ghép nối sản phẩm PCR đã tinh sạch vào vector pJET 1.2 sử dụng bộ hóa chất CloneJET PCR Cloning Kit. Vector pJET 1.2 có chứa điểm khởi đầu sao chép nên có khả năng sao chép độc lập với hệ gen của tế bào chủ E. coli. Gen kháng kháng sinh Ampicilin (Amp) có trên vector cho phép chọn lọc những tế bào có mang vector này trên môi trường có bổ sung kháng sinh Ampicillin. Ngoài ra, vector này còn chứa gen eco47IRI mã hóa cho nuclease phân hủy DNA gây chết tế bào vật chủ. Khi đoạn chèn được gắn vào vector thì gen này bị bất hoạt. Vì vậy, quá trình chọn dòng khuẩn lạc có mang plasmid tái tổ hợp sẽ hiệu quả hơn. Mặt khác, trên vùng MCS (Multiple cloning site) chứa các điểm nhận biết của các enzyme giới hạn như: BglII, NotI, XhoI,… giúp dễ dàng kiểm tra đoạn DNA được chèn vào. Sản phẩm của phản ứng ghép nối sau đó được biến nạp vào tế bào khả biến E. coli DH5α. Các tế bào này sau đó được nuôi cấy trên môi trường LB đặc có bổ sung kháng sinh Ampicillin (50µg/ml) ở 37oC qua đêm. Quan sát kết quả trên đĩa cấy trải, chúng tôi thu được nhiều khuẩn lạc đơn là các dòng tế bào vi khuẩn mang plasmid. Để xác định xem các plasmid này có mang đoạn DNA cần tách dòng hay không, chúng tôi đã tiến hành tách chiết plasmid từ một số khuẩn lạc để kiểm tra.
Chúng tôi chọn 22 khuẩn lạc đơn trên đĩa thạch LB, sau đó nuôi cấy trong môi trường LB lỏng có bổ sung kháng sinh Ampicillin (50µg/ml ) ở 37oC qua đêm. Các plasmid sau khi tách chiết được điện di kiểm tra trên gel agarose 0.8% (hình 3.4).
Hình 3.4: Tách chiết và chọn lọc plasmid mang gen ZmbZIP72
1 – 22: 22 dòng plasmid tách chiết được từ 22 khuẩn lạc đơn
Theo lý thuyết, các plasmid mang đoạn gen ngoại lai sẽ có kích thước lớn hơn. Vì vậy, khi so sánh độ cao thấp giữa các plasmid với nhau, chúng tôi lựa chọn ra được 3 dòng: 4, 12, 20 có khả năng mang đoạn chèn cao hơn so với các dòng khác. Ba dòng này được cắt kiểm tra bằng enzyme giới hạn.
Khi phân tích vùng MSC của vector pJET 1.2, chúng tôi thấy rằng ở phía bên trái và bên phải của vị trí ghép nối gen đều chứa điểm nhận biết enzyme BglII. Vì vậy, chúng tôi sử dụng enzyme BglIIđể cắt kiểm tra ba dòng số 4, 12, 20. Sản phẩm sau khi xử lý bằng enzyme giới hạn được điện di kiểm tra trên gel agarose 0.8% (hình 3.5). Kết quả cho thấy, dòng số 20 xuất hiện hai băng, một có kích thước xấp xỉ 3kb và một băng có kích thước khoảng 1kb. Hai kích thước này tương ứng với kích thước của vector và đoạn gen
ZmbZIP72 (953 bp) cùng với một số nucleotide trong vùng MCS của vector pJET 1.2. Như vậy, qua kết quả kiểm tra bằng enzyme giới hạn có thể dự đoán rằng đoạn chèn gắn vào là đoạn gen đích. Dòng plasmid trên sau đó được xác định trình tự nucleotide theo phương pháp Sanger.
Hình 3.5: Kiểm tra plasmid pJET 1.2 mang đoạn gen ZmbZIP72
M: maker 1kb, 1: dòng số 4, 2: dòng số 12, 3: dòng số 20