CHƯƠNG 1 : TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.10. Điện di trên gel agarose
2.2.10.1. Điện di DNA trên gel agarose
Quy trình thực hiện:
1 Chuẩn bị gel: agarose 0,8% được đun sôi, để nhiệt độ hạ xuống khoảng 50-60˚C, đổ dung dịch agarose vào khay gel đã cài sẵn lược thích hợp. Sau 30 - 60 phút, khi gel đã đông ổn định, tháo lược, đặt khay gel vào bể điện di. Đổ đệm TAE 1X ngập cách mặt gel khoảng 2 mm.
2 Tra mẫu: Mẫu DNA được trộn cùng với đệm tra mẫu theo tỷ lệ thể tích 2:1. Sau đó, mẫu được tra vào các giếng trên bản gel.
3 Tiến hành điện di với dòng điện 1 chiều có hiệu điện thế 100V, cường độ dòng điện 60 - 80 mA, quan sát sự di chuyển của vệt màu bromophenol blue để kết thúc điện di vào thời gian phù hợp.
4 Nhuộm DNA bằng EtBr: Bản gel được lấy ra khỏi khuôn và ngâm vào dung dịch EtBr nồng độ 10 µg/ml trong thời gian 5- 10 phút. Bản gel sau đó rửa sạch bằng nước cất.
5 Quan sát và chụp ảnh: Bản gel được quan sát dưới ánh sáng tử ngoại bước sóng 254 nm. Khi đó, DNA đã nhuộm sẽ hiện lên dưới dạng các vạch sáng và được ghi lại bằng máy GEL - DOC.
2.2.10.2. Điện di RNA trên gel agarose
RNA là một acid nucleic sợi đơn nhưng chúng có xu hướng hình thành cấu trúc thứ cấp vì vậy trước khi điện di RNA tổng số cần làm biến tính RNA để chúng luôn duy trì ở trạng thái sơi đơn.
Chuẩn bị MOPS buffer, RNA loading buffer, RNA sample buffer:
- 5X MOPS buffer: MOPS (pH 7.0) 0.2M, EDTA (pH 8.0) 0.005M, Sodium acetate 0.05M.
- RNA sample buffer: 10 ml Deionized formamide, 3.5 ml formaldehyde 37%, 2 ml MOPS buffer.
- RNA loading buffer: glycerol 50%, EDTA 10mM, bromophenol blue 0.4%. Quy trình thực hiện:
1 Chuẩn bị gel: agarose 1% được đun sôi, để nhiệt độ hạ xuống khoảng 50-60˚C, đổ dung dịch agarose vào khay gel đã cài sẵn lược thích hợp. Sau 30 - 60 phút, khi gel đã đông ổn định, tháo lược, đặt khay gel vào bể điện di. Đổ đệm TAE 1X ngập cách mặt gel khoảng 2 mm.
2 Tra mẫu: Mẫu RNA được trộn cùng với RNA sample buffer và RNA loading buffer. Sau đó, mẫu được tra vào các giếng trên bản gel.
3 Tiến hành điện di với dòng điện 1 chiều có hiệu điện thế 100V, cường độ dòng điện 60 - 80 mA, quan sát sự di chuyển của vệt màu bromophenol blue để kết thúc điện di vào thời gian phù hợp.
4 Nhuộm RNA bằng EtBr: Bản gel được lấy ra khỏi khuôn và ngâm vào dung dịch EtBr nồng độ 10 µg/ml trong thời gian 5- 10 phút. Bản gel sau đó rửa sạch bằng nước cất.
5 Quan sát và chụp ảnh: Bản gel được quan sát dưới ánh sáng tử ngoại bước sóng 254 nm. Khi đó, RNA đã nhuộm sẽ hiện lên dưới dạng các vạch sáng và được ghi lại bằng máy GEL - DOC.