Quy trình thực hiện:
1 Tạo dịch huyền phù: Cấy khuẩn lạc vi khuẩn A. tumefaciens chứa plasmid quan tâm trong môi trường LB đặc sang môi trường LB lỏng có bổ sung kháng sinh thích hợp và lắc ở 200 vòng/phút, 28oC, tiến hành nuôi qua đêm. Sau 8 - 12 giờ lấy dịch huyền phù vi khuẩn nuôi cấy trên ly tâm với tốc độ 5000 vòng/phút, ở 4°C trong 5 phút. Loại bỏ dịch nổi và hoà tan cặn vi khuẩn bằng môi trường lây nhiễm có bổ sung AS. Pha loãng dịch khuẩn cho tới khi đạt được OD600: 0.5-1.0. Dịch huyền phù vi khuẩn được sử dụng để lây nhiễm với phôi non của ngô. 2 Lây nhiễm vi khuẩn với phôi: Bắp ngô non được thu từ các cây ngô mẹ trồng
ngoài đồng ruộng từ 10 đến 12 ngày. Ngay sau khi thu hái, phôi non được tách trong điều kiện vô trùng và được lây nhiễm với dịch vi khuẩn có bổ sung AS nồng độ 100 µM trong 20 phút.
3 Đồng nuôi cấy: Phôi sau khi lây nhiễm với vi khuẩn được chuyển sang môi trường đồng nuôi cấy, nuôi trong tối, ở nhiệt độ 21oC trong 3 ngày.
4 Nuôi phục hồi: Chuyển phôi đã biến nạp từ môi trường đồng nuôi cấy sang môi trường phục hồi, nuôi trong tối ở 28oC, trong 7 ngày.
5 Chọn lọc mô sẹo: Mô sẹo tạo thành từ phôi non được cấy chuyển từ môi trường phục hồi sang môi trường chọn lọc 1 có bổ sung kháng sinh hygromycin (1,5 mg/l), nuôi trong tối ở 28°C, trong 14 ngày. Sau đó, các mô sẹo tiếp tục được chuyển sang môi trường chọn lọc 2 có nồng độ kháng sinh hygromycin (3mg/l), nuôi tối 14 ngày/ 28oC.
6 Tạo chồi: Các mô sẹo phôi hoá tạo thành trên môi trường chọn lọc được cấy chuyển sang môi trường tái sinh 1, không có chất kích thích sinh trưởng, nuôi
trong tối 7 ngày/ 25oC/. Các mô sẹo phôi hoá này tiếp đó được cấy chuyển sang môi trường tái sinh 2 không bổ sung kháng sinh, nuôi ngoài sáng ở 25oC, liên tục chuyển môi trường tái sinh 2 cho đến khi các mô sẹo phôi hoá này tạo thành các chồi.
7 Tái sinh cây chuyển gen hoàn chỉnh: Chồi tái sinh trong môi trường tái sinh được cấy chuyển sang môi trường tạo cây hoàn chỉnh ở điều kiện sáng 25oC, trong khoảng 10 - 20 ngày.
8 Chuyển cây ra đất: Cây tái sinh trên môi trường tái sinh khi có khoảng 2 - 3 láđược chuyển ra đất trồng.
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. PHÂN LẬP GEN ZmBZIP72 TỪ CÂY NGÔ
3.1.1. Tách chiết RNA tổng số từ mẫu mô lá ngô
Chúng tôi đã tiến hành xử lý hạn giống ngô Tẻ vàng chắt dạo (Lai Châu) giai đoạn ba lá trong 3và 6 giờ theo quy trình của nhóm nghiên cứu trên, và tiến hành thu thập các mẫu lá của các cây này để tách chiết RNA tổng số phục vụ thí nghiệm. Trong nghiên cứu, chúng tôi thực hiện tách chiết RNA tổng số theo phương pháp sử dụng TRI Reagent với quy trình như đã mô tả như ở phần phương pháp.
Phân tử RNA không bền, dễ bị phân hủy bởi các enzyme RNase. Hơn nữa, RNase có mặt ở khắp nơi, có hoạt tính cao và rất bền vững với các tác nhân thường dùng để loại bỏ enzyme (việc xử lý nhiệt ở 90oC trong 1 giờ không làm mất hoạt tính RNase). Vì những lý do đó, việc tách chiết RNA đòi hỏi sự thận trọng để tránh mọi tạp nhiễm bởi các RNase từ môi trường: thao tác trong điều kiện vô trùng, mọi dụng cụ, hóa chất đều được khử trùng bằng nhiệt hay DEPC (Diethylpyrocarbonate), tránh mọi tiếp xúc với dụng cụ bằng tay trần.
Các mẫu mô sau khi được nghiền mịn trong nitơ lỏng, cần được bổ sung ngay TRI Reagent để hạn chế sự hoạt động của RNase. TRI Reagent có chứa hai chất biến tính protein mạnh là phenol và guanidin isothiocyanate, khi được xử lý với hai hóa chất này, tế bào sẽ bị phá vỡ và giải phóng các thành phần nội bào: DNA, RNA, protein...
Sau khi phá vỡ được màng tế bào và màng nhân, việc tiếp theo là phải tiến hành loại protein và phân tách riêng các phần không chứa RNA trong hỗn hợp dung dịch chiết. Ở đây chúng tôi sử dụng chloroform để loại bỏ protein và tạp chất. Sau khi bổ sung chloroform và ly tâm, hỗn hợp dung dịch chiết phân chia thành ba pha riêng biệt: trên cùng là pha dịch chứa RNA; pha giữa chứa DNA; pha cuối là protein, cặn tế bào cùng các hợp hợp chất khác. Giữa pha trên và pha dưới được ngăn cách nhau bởi một lớp màng.
Dịch thu được ở pha trên sẽ được tủa bằng việc bổ sung 2-propanol. RNA thu được sau đó được làm sạch bằng cồn 70%. Sản phẩm RNA sau đó được kiểm tra trên gel agarose
1% (hình 3.1). Kết quả cho thấy RNA tổng số có độ sạch cao và khoảng smear đậm quanh vùng 18S – 28S cho thấy thu được lượng mRNA khá nhiều.
Hình 3.1: Sản phẩm tách chiết RNA tổng số từ mẫu mô lá ngô xử lý hạn nhân tạo M: maker 1kb, 1: RNA tổng số tách chiết từ mẫu lá ngô xử lý hạn 3 giờ, 2: RNA
tổng số tách chiết từ mẫu lá ngô xử lý hạn 6 giờ
3.1.2. Tổng hợp cDNA sợi thứ nhất
RNA tổng số sau khi kiểm tra chất lượng được chúng tôi sử dụng làm khuôn mẫu để tổng hợp cDNA sợi thứ nhất theo First-Strand cDNA Synthesis Kit for Real - Time PCR. Để tổng hợp cDNA sợi thứ nhất chúng tôi sử dụng mồi primer mix đi kèm theo bộ Kit. Sau đó, chúng tôi kiểm tra chất lượng cDNA tổng hợp được bằng phản ứng PCR với cặp mồi nhân gen Actin. Sản phẩm PCR được điện di kiểm tra trên gel agarose 1.5% (Hình 3.2).
Hình 3.2: Sản phẩm PCR nhân gen Actin từ các mẫu cDNA
M: maker 1kb plus, 1: sản phẩm PCR từ cDNA của mẫu cây xử lý hạn 3 giờ, 2: sản phẩm PCR từ cDNA của mẫu cây xử lý hạn 6 giờ
Qua ảnh điện di, chúng tôi thấy rằng trên đường chạy 1 và 2 xuất hiện băng đậm nét với kích thước xấp xỉ 500bp đúng với kích thước dự đoán khi thiết kế cặp mồi nhân gen
Actin là 480bp. Điều đó chứng tỏ chúng tôi đã tổng hợp thành công cDNA. Mẫu cDNA này sẽ được sử dụng làm DNA khuôn trong phản ứng nhân gen ZmbZIP72 sau đó.
3.1.3. RT-PCR nhân gen ZmbZIP72
Phản ứng PCR được thực hiện với khuôn mẫu là cDNA, sử dụng enzyme DreamTaq polymerase với cặp mồi ZmbZIP72F/R nhiệt độ gắn mồi 60oC. Kết quả điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 0.8% (hình 3.3) cho thấy xuất hiện băng DNA kích thước xấp xỉ 1kb, kích thước này đúng với dự đoán khi chúng tôi thiết kế cặp mồi đặc hiệu nhân gen
ZmbZIP72 dựa trên trình tự tham chiếu trên Ngân hàng gen NCBI (mã số: HQ328839) (953bp). Sản phẩm PCR sau đó được tinh sạch bằng kit PCR GeneJET Gel Extraction Kit cho các thí nghiệm tiếp theo.
Hình 3.3: Kết quả RT-PCR nhân gen ZmbZIP72
M: maker 1kb, 1: sản phẩm RT-PCR nhân gen ZmbZIP72 từ cDNA mẫu lá ngô Tẻ vàng chắt dạo (Lai Châu) xử lý hạn 6 giờ
3.1.4. Tạo dòng gen ZmbZIP72 trong vector pJET1.2
Nhằm mục đích tạo dòng và xác định trình tự nucleotide đoạn gen, chúng tôi tiến hành ghép nối sản phẩm PCR đã tinh sạch vào vector pJET 1.2 sử dụng bộ hóa chất CloneJET PCR Cloning Kit. Vector pJET 1.2 có chứa điểm khởi đầu sao chép nên có khả năng sao chép độc lập với hệ gen của tế bào chủ E. coli. Gen kháng kháng sinh Ampicilin (Amp) có trên vector cho phép chọn lọc những tế bào có mang vector này trên môi trường có bổ sung kháng sinh Ampicillin. Ngoài ra, vector này còn chứa gen eco47IRI mã hóa cho nuclease phân hủy DNA gây chết tế bào vật chủ. Khi đoạn chèn được gắn vào vector thì gen này bị bất hoạt. Vì vậy, quá trình chọn dòng khuẩn lạc có mang plasmid tái tổ hợp sẽ hiệu quả hơn. Mặt khác, trên vùng MCS (Multiple cloning site) chứa các điểm nhận biết của các enzyme giới hạn như: BglII, NotI, XhoI,… giúp dễ dàng kiểm tra đoạn DNA được chèn vào. Sản phẩm của phản ứng ghép nối sau đó được biến nạp vào tế bào khả biến E. coli DH5α. Các tế bào này sau đó được nuôi cấy trên môi trường LB đặc có bổ sung kháng sinh Ampicillin (50µg/ml) ở 37oC qua đêm. Quan sát kết quả trên đĩa cấy trải, chúng tôi thu được nhiều khuẩn lạc đơn là các dòng tế bào vi khuẩn mang plasmid. Để xác định xem các plasmid này có mang đoạn DNA cần tách dòng hay không, chúng tôi đã tiến hành tách chiết plasmid từ một số khuẩn lạc để kiểm tra.
Chúng tôi chọn 22 khuẩn lạc đơn trên đĩa thạch LB, sau đó nuôi cấy trong môi trường LB lỏng có bổ sung kháng sinh Ampicillin (50µg/ml ) ở 37oC qua đêm. Các plasmid sau khi tách chiết được điện di kiểm tra trên gel agarose 0.8% (hình 3.4).
Hình 3.4: Tách chiết và chọn lọc plasmid mang gen ZmbZIP72
1 – 22: 22 dòng plasmid tách chiết được từ 22 khuẩn lạc đơn
Theo lý thuyết, các plasmid mang đoạn gen ngoại lai sẽ có kích thước lớn hơn. Vì vậy, khi so sánh độ cao thấp giữa các plasmid với nhau, chúng tôi lựa chọn ra được 3 dòng: 4, 12, 20 có khả năng mang đoạn chèn cao hơn so với các dòng khác. Ba dòng này được cắt kiểm tra bằng enzyme giới hạn.
Khi phân tích vùng MSC của vector pJET 1.2, chúng tôi thấy rằng ở phía bên trái và bên phải của vị trí ghép nối gen đều chứa điểm nhận biết enzyme BglII. Vì vậy, chúng tôi sử dụng enzyme BglIIđể cắt kiểm tra ba dòng số 4, 12, 20. Sản phẩm sau khi xử lý bằng enzyme giới hạn được điện di kiểm tra trên gel agarose 0.8% (hình 3.5). Kết quả cho thấy, dòng số 20 xuất hiện hai băng, một có kích thước xấp xỉ 3kb và một băng có kích thước khoảng 1kb. Hai kích thước này tương ứng với kích thước của vector và đoạn gen
ZmbZIP72 (953 bp) cùng với một số nucleotide trong vùng MCS của vector pJET 1.2. Như vậy, qua kết quả kiểm tra bằng enzyme giới hạn có thể dự đoán rằng đoạn chèn gắn vào là đoạn gen đích. Dòng plasmid trên sau đó được xác định trình tự nucleotide theo phương pháp Sanger.
Hình 3.5: Kiểm tra plasmid pJET 1.2 mang đoạn gen ZmbZIP72
M: maker 1kb, 1: dòng số 4, 2: dòng số 12, 3: dòng số 20
3.1.5. Xác định và phân tích trình tự gen ZmbZIP72
Trình tự đoạn gen ZmbZIP72 được xác định bằng máy giải trình ABI 3500, sử dụng cặp mồi pJET1.2 F/R để xác định trình tự nucleotide trên plasmid tái tổ hợp theo cả hai chiều. Kết hợp giữa kết quả giải trình tự mồi pJET1.2 F và mồi pJET1.2 R chúng tôi có được trình tự đầy đủ của gen ZmbZIP72 có kích thước 953 bp. Kết quả xác định trình tự nucleotide được xử lý bằng phần mềm BioEdit và so sánh trình tự này với trình tự tham chiếu trên Ngân hàng gen (mã số: HQ328839), chúng tôi thấy rằng, hai đoạn gen có độ tương đồng 99%, với 2 điểm thay đổi: vị trí 486 A>C và vị trí 493 C>T (hình 3.6).
Hình 3.6: So sánh trình tự nucleotide giữa đoạn gen ZmbZIP72 từ giống Tẻ vàng chắt dạo (Lai Châu) với trình tự tham chiếu
ZmbZIP72:trình tự tham chiếu trên Ngân hàng gen mã số: HQ328839
bZIP72 clone: trình tự đoạn gen ZmbZIP72 phân lập từ giống Tẻ vàng chắt dạo (Lai Châu)
Sử dụng công cụ online http://insilico.ehu.es/translate/ để dịch mã đoạn gen thu được từ giống Tẻ vàng chắt dạo (Lai Châu) chúng tôi có được trình tự acid min suy diễn của đoạn nucleotide dài 894bp với 297 aa, tương ứng với trình tự acid amin của protein ZmbZIP72 trong CSDL của NCBI mã số ADO19904. Kết quả so sánh (hình 3.7) cho thấy, hai vị trí nucleotide bị thay đổi trong vùng CDS dẫn đến sự thay đổi trình tự acid amin, với thay đổi A>C dẫn tới mã bộ ba AAA>AAC và làm cho Lysine>Asparagine. Với thay đổi C>T làm cho mã CCT > TCT dẫn tới Proline> Serine. Tuy nhiên, các thay đổi acid amin này đều không thuộc vùng chức năng quan trọng của protein ZmbZIP72 như vùng lõi, vùng gắn protein, những thay đổi này có thể là sự đa hình của gen ZmbZIP72 ở giống Tẻ vàng chắt dạo (Lai Châu) so với giống CN165. Từ các kết quả thu được, chúng tôi có thể khẳng định đã phân lập và tách dòng thành công gen ZmbZIP72 từ giống ngô Tẻ vàng chắt dạo (Lai Châu) với độ dài 953bp bao gồm toàn bộ vùng CDS dài 894bp và 21bp thuộc vùng 5’ trước mã mở đầu và 38bp vùng 3’ sau mã kết thúc.
Hình 3.7: So sánh trình tự acid amin suy diễn của đoạn CDS trên đoạn gen ZmbZIP72
giống Tẻ vàng chắt dạo (Lai Châu) với trình tự tham chiếu
ZmbZIP72: Trình tự acid amin của protein ZmbZIP72 trong CSDL của NCBI: ADO19904
ZmbZIP72clone: Trình tự acid amin suy diễn đoạn gen ZmbZIP72 phân lập từ giống Tẻ vàng chắt dạo (Lai Châu)
3.2. Thiết kế các vector tái tổ hợp mang gen ZmbZIP72
3.2.1. PCR nhân gen ZmbZIP72 với cặp mồi treo vị trí enzyme SacI
Sau khi đoạn gen ZmbZIP72 được phân lập và tạo dòng trong vector pJET1.2, chúng tôi sử dụng plasmid tái tổ hợp mang gen ZmbZIP72 làm khuôn cho phản ứng PCR với cặp mồi ZmbZIP72 SacIF/SacIR, đoạn gen được nhân lên với cặp mồi này sẽ có kích thước 894bp bao gồm toàn bộ vùng CDS của gen (hình 3.8).
Hình 3.8: Kiểm tra sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi ZmbZIP72SacI F/R
M: maker 1kb, 1: sản phẩm PCR nhân vùng CDS gen ZmbZIP72
Quan sát kết quả điện di, chúng tôi thấy rằng trên đường chạy xuất hiện băng DNA có kích thước ~1kb, kích thước này đúng với kích thước dự đoán khi chúng tôi thiết kế mồi. Sau đó, chúng tôi thực hiện PCR lượng lớn để tinh sạch và tạo dòng trong vector tách dòng pJET 1.2 theo quy trình của bộ kit CloneJET PCR Cloning Kit. Kết quả là chúng tôi thu được 3 dòng plasmid tái tổ hợp mang gen ZmbZIP72: 01, 05, 09 khi kiểm tra bằng enzyme giới hạn SacI (hình 3.9). Dòng 01 được chúng tôi tiếp tục sử dụng cho các thí nghiệm tiếp sau đó.
Hình 3.9: Kết quả cắt enzyme giới hạn BglII trên các plasmid pJET 1.2 M: maker 1kb, 1: dòng số 01, 2: dòng số 05, 3: dòng số 09
3.2.2. Thiết kế vector trung gian mang gen ZmbZIP72
Để biểu hiện gen trong tế bào thực vật, gen ZmbZIP72 cần được đặt dưới sự điều khiển của promoter và terminator thích hợp. Chúng tôi lựa chọn promoter RD29A và terminator 35S để điều khiểu sự hoạt động của gen ZmbZIP72 trong thực vật. Chúng tôi ghép nối đoạn gen ZmbZIP72 với vector tách dòng trung gian pRTL2 có kích thước 2.6kb chứa đoạn trình tự cần thiết cho biểu hiện gen gồm promoter cảm ứng stress RD29A kích thước 841bp và terminator 35S dài 246bp, gen đích được chèn vào giữa tại điểm nhận biết của enzyme SacI. Nếu cấu trúc RD29A::ZmbZIP72::35S được gắn đúng sẽ có kích thước 1991bp. Đoạn gen ZmbZIP72 được tạo đầu dính tương ứng bằng enzyme SacI. Đồng thời, vector pRTL2 cũng được xử lý bằng enzyme SacI để mở vòng và ghép nối với nhau sau đó biến nạp vào tế bào vi khuẩn E. coli DH10β theo phương pháp sốc nhiệt. Các tế bào này sau đó được nuôi cấy trên môi trường LB đặc có bổ sung kháng sinh chọn lọc Ampicillin (50µg/ml) ở 37oC qua đêm. Quan sát kết quả trên đĩa cấy trải, chúng tôi thu được nhiều khuẩn lạc đơn là các dòng tế bào vi khuẩn mang plasmid. Để xác định xem các plasmid này có mang đoạn DNA đích hay không, chúng tôi chọn 36 khuẩn lạc đơn trên đĩa biến nạp nuôi cấy trong môi trường LB lỏng có bổ sung kháng sinh Ampicillin (50µg/ml) ở 37oC qua đêm để tách chiết plasmid. Các plasmid từ các dòng vi khuẩn sau khi tách chiết được điện di kiểm tra trên gel agarose 0.8% (hình 3.10).
Hình 3.10: Tách chiết và chọn lọc plasmid pRTL2 mang gen ZmbZIP72
1 – 36: 36 dòng plasmid được tách chiết; (-): đối chứng âm là plasmid pRTL2 gốc không mang đoạn chèn
Quan sát ảnh điện di, chúng tôi chọn được một dòng plasmid số 32 có khả năng mang vector tái tổ hợp pRTL2-bZIP72. Plasmid này được xử lý với enzyme giới hạn HindIII để kiểm tra sự có mặt của cấu trúc biểu hiện, kết quả điện di trên gel agarose 08% (hình 3.11) thấy xuất hiện hai băng kích thước khoảng 2.6kb và 2k. Hai sản phẩm cắt này đúng với