CHƯƠNG 3 : KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.3. Tạo chủng A.tumefaciens mang cấu trúc biểu hiện gen ZmbZIP72
Một đặc tính tự nhiên của vi khuẩn A. tumefaciens là khả năng chuyển một số gen trên Ti-plasmid vào hệ gen tế bào thực vật. Nhờ có đặc điểm này nên vi khuẩn A. tumefaciens được sử dụng rất phổ biến trong nghiên cứu chuyển gen thực vật. Trong nghiên cứu này, nhằm phục vụ công việc nghiên cứu chức năng nhân tố phiên mã bZIP72 trong cây mô hình, chúng tôi đã sử dụng phương pháp biến nạp gen vào tế bào thực vật thông qua vi khuẩn A. tumefaciens chủng EHA105. Để thực hiện thí nghiệm chuyển gen vào cây mô hình, các chủng vi khuẩn A. tumefaciens tái tổ hợp mang các cấu trúc biểu hiện gen được tạo ra bằng phương pháp xung điện. Các thể biến nạp sau khi được sàng lọc bằng môi trường nuôi cấy có bổ sung chất kháng sinh Kanamycin (100µg/ml) được tiếp tục tách plasmid để kiểm tra sự có mặt của vector biểu hiện gen bằng phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu ZmbZIP72SacI F/R.
Chúng tôi tiến hành tách chiết plasmid từ 4 dòng khuẩn lạc đơn trên đĩa biến nạp. Các plasmid này sau đó được sử dụng làm khuôn cho phản ứng PCR kiểm tra sự có mặt của cấu trúc biểu hiện gen ZmbZIP72 với cặp mồi đặc hiện ZmbZIP72SacI F/R. Sản phẩm PCR điện di kiểm tra trên gel agarose 0.8% (hình 3.16). Quan sát kết quả điện di thì thấy rằng, đối chứng dương xuất hiện một băng đậm, sáng rõ, điều này chứng tỏ phản ứng diễn ra bình thường. Trong khi đó, đối chứng âm không xuất hiện băng DNA, chứng tỏ không có sự tạp nhiễm trong quá trình thao tác thí nghiệm. Trong các mẫu thì chỉ có 1 dòng 01, cho một băng DNA đậm, rõ nét, có kích thước khoảng 0.9kb bằng với kích thước của đối chứng dương, tương ứng với kích thước đoạn gen đích. Kết quả này, có thể nói rằng chúng tôi đã thu được thể biến nạp Agrobacterium có mang cấu trúc biểu hiện gen đích ZmbZIP72
điểu khiển bởi promoter RD29A. Đây là nguồn nguyên liệu sử dụng cho các thí nghiệm nhằm chuyển gen ZmbZIP72 vào thực vật.
Các cây trồng chuyển gen nếu được tạo ra với một gen chức năng nằm dưới sự điều khiển của promoter cơ định thường dẫn đến sự biểu hiện của các gen đích trong tất cả các mô và cơ quan của thực vật ở tất cả các giai đoạn phát triển và đôi khi ảnh hưởng đến sự tăng trưởng và phát triển của thực vật chuyển gen. Trong các nghiên cứu trước đây, việc
sử dụng promoter RD29A điều khiển gen là yếu tố phiên mã cho thấy nhiều lợi ích so với promoter CaMV35S (Yamaguchi-Shinozaki and Shinozaki, 1993; Kasuga et al., 2004; Pellegrineschi et al., 2004). RD29A chứa yếu tố đáp ứng mất nước (DRE) có thể cảm ứng stress. Trong điều kiện bình thường, sự biểu hiện của các gen đích dưới sự điều khiển của promoter RD29A chỉ ở mức độ thấp nhưng sự biểu hiện sẽ tăng nhanh khi bị mất nước. (Yamaguchi-Shinozaki and Shinozaki, 1994). Trong nghiên cứu của Zhou và cộng sự (2016), các cây thuốc lá chuyển gen TaFBA1 được điều khiển bởi promoter 35S có kiểu hình rất khác so với các cây không chuyển gen trong điều kiện nước bình thường. Trong khi đó, các cây chuyển gen TaFBA1 do promoter RD29A điều khiển thì sự sinh trưởng và phát triển tương tự như các cây không chuyển gen trong điều kiện bình thường. Với nguồn nguyên liệu về gen đã có trong nghiên cứu này, và việc lựa chọn promoter RD29A với các ưu điểm trên để điều khiển sự biểu hiện của gen ZmbZIP72, chúng tôi hi vọng rằng các cây chuyển gen tăng cường được khả năng chịu hạn, đồng thời, hạn chế được các ảnh hưởng tiêu cực đến sự sinh trưởng và phát triển của cây.
Hình 3.16: Sản phẩm PCR nhân đoạn gen ZmbZIP72 từ 4 dòng plasmid M: maker 1kb, (+): đối chứng dương với khuôn là plasmid pCAM1300_ZmbZIP72