H. pylori là vi khuẩn Gam dương vi ái khí, dạng dấu phẩy, chữ S hoặc C. Dưới kính hiển vi điện tử, H. pylori dài khoảng 1,5 - 5µm, cĩ đường kính 0,3-1µm, cĩ 1-6 lơng mảnh ở 1 đầu. Trong điều kiện khơng thuận lợi hoặc sau điều trị một số kháng sinh H. pylori cĩ thể biến thành dạng cầu, và thường nằm trong lớp chất nhầy phủ bề mặt niêm mạc dạ dày, bám trên mặt ngọn hoặc chui sâu giữa các tế bào biểu mơ dạ dày, cĩ khi thấy H. pylori trong lịng các khe tuyến nơng trên gần bề mặt các niêm mạc [107].
Hình 1.1. Hình ảnh H. pylori với các lơng roi ở đầu
(Nguồn: http:// www. medlatec. vn)
- Cấu trúc gien của Helicobacter pylori: Đến nay người ta đã xác định được rằng cĩ ít nhất 9 gien trong cụm gien đảm nhiệm việc tổng hợp urease của H. pylori đĩ là các gien sau: A,B,C,D,E,F,G,H và I. Trong đĩ gien A,B là gien cấu trúc cịn các gien ure F,G,H là gien điều hịa [108]. Ngồi cụm gien tổng hợp urease, trong số 1550 gien đã biết của H. pylori cĩ một số gien quan trọng khác cĩ liên quan nhiều tới các bệnh VDD, loét DD-TT và UTDD đĩ là
CagA và VacA. CagA (cytotoxin Associated gene): CagA là một protein cĩ trọng lượng phân tử 120-140 Kda là biểu hiện của gien CagA, gien này được định vị trong các chuỗi ADN của hệ gien H. pylori, vị trí của nĩ ở vùng tiểu đảo sinh bệnh (PAI: pathogenicity island) [2]. VacA (Vacuolating cytotoxin gene): Là độc tố gây rỗng tế bào do gien VacA của H. pylori sản xuất ra, cĩ
trọng lượng phân tử 87 Kda. Gien này được sản xuất bởi khoảng 60% các chủng H. pylori và gần 100% các chủng H. pylori ở bệnh nhân loét hành tá tràng, người ta thấy rằng mặc dầu các chủng đều cĩ gien VacA nhưng chỉ cĩ khoảng 40% sản xuất được tế bào làm tổn thương tế bào biểu mơ [2].
1.5. Các phương pháp chẩn đốn nhiễm H. pylori
1.5.1. Các phương pháp cần nội soi tiêu hĩa
Phương pháp nội soi được áp dụng từ những năm của thập kỷ 70, được thực hiện bởi Warren và Marshall khi kiểm tra tồn bộ dạ dày và lấy mảnh sinh thiết để phục vụ chẩn đốn phát triển sự cĩ mặt của H. pylori. Để cĩ kết quả tối ưu cần tuân thủ những nguyên tắc cơ bản khi lấy mẫu sinh thiết [109].
1.5.1.1. Phương pháp chẩn đốn tế bào học
Là phương pháp soi tìm vi khuẩn H. pylori trực tiếp từ mẫu sinh thiết phết trên lam kính và nhuộm theo cách thơng thường (Gram, Giemsa hoặc Fucxin) hoặc soi kính hiển vi đối quang phân kỳ. Độ nhậy của phương pháp này là 75-85% độ đặc hiệu giống như trong xét nghiệm mơ bệnh học [110].
1.5.1.2. Phương pháp chẩn đốn mơ bệnh học
Phương pháp mơ bệnh học được coi là phương pháp chuẩn vàng nếu khơng cĩ điều kiện nuơi cấy vi khuẩn. Nhuộm HE và Giemsa được sử dụng thường quy vì rẻ tiền, đơn giản dễ thực hiện, nhưng độ nhạy khơng cao (33- 90% tùy kinh nghiệm người đọc). Các phương pháp nhuộm Giemsa - Romanowsky cải tiến và nhất là các phương pháp nhuộm bạc (Dieterle, warthin-starry, steiner, Gienta) cĩ độ nhạy trên 90%. Gần đây phương pháp hĩa mơ miễn dịch (Immunohistochemical) dùng kháng thể đặc hiệu kháng H. pylori cĩ độ nhậy rất cao nhưng tốn kém nên ít sử dụng rộng rãi. Nhiều nhà nghiên cứu đã lấy nĩ làm xét nghiệm quy chiếu để đánh giá độ nhậy và độ đặc hiệu của phương pháp khác [110]. Tại Việt Nam, phương pháp nhuộm
Giemsa và Hematoxylin - Eosin (HE) thường được sử dụng để phát hiện sự cĩ mặt của vi khuẩn.
1.5.1.3. Phương pháp phát hiện urease của H. pylori trong mảnh sinh thiết
Nguyên lý của phương pháp này dựa trên đặc điểm sinh học của H. pylori cĩ hệ men urê rất phong phú nhanh chĩng phân hủy urê thành ammoniac và bicarbonate làm mơi trường trở nên kiềm hĩa và làm thay đổi chỉ thị màu cĩ trong ống nghiệm.
Urê Ammoniac + Bicarbonate (NH2)2CO2 + 2H2O+ H+ urease 2NH4+ + HCO-
3
Nguyên lý test urease (theo Bruleydes vanes, 1997)
Độ nhạy của thử nghiệm phụ thuộc vào số lượng vi khuẩn trong mẫu bệnh phẩm, chính vì vậy nĩ cĩ thể sử dụng để đánh giá sàng lọc sau điều trị thất bại [111]. Độ nhạy 90%, độ đặc hiệu 100% khi đọc kết quả sau 10 phút. Tuy nhiên, phản ứng dương tính giả cĩ thể xảy ra do nhiễm với vi khuẩn sinh urease ở khoang miệng (sau 24 giờ) hoặc bệnh nhân đã dùng thuốc ức chế bơm proton [111]. Từ 2003, tại Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương Việt Nam các nhà nghiên cứu đã sử dụng cơng thức tự chế, với thời gian được kết quả tối đa sau 5 phút đạt độ đặc hiệu của test là 98% trong nghiên cứu quần thể bệnh nhân loét dạ dày tá tràng tại Việt Nam.
1.5.1.4. Phương pháp nuơi cấy vi khuẩn
Nuơi cấy vi khuẩn dương tính được coi là tiêu chuẩn vàng. Tỷ lệ nuơi cấy H. pylori từ mảnh sinh thiết đạt từ khoảng 50% đến 70% và cịn tùy thuộc vào kinh nghiệm, khả năng của các phịng thí nghiệm. Mơi trường nuơi cấy
H. pylori là mơi trường chuyên biệt như pylori agar, shirrow cải tiến hoặc mơi trường cĩ 5-7% máu ngựa hoặc cừu như mơi trường Columbia, Burcella, BHI cho thêm các yếu tố giàu dinh dưỡng và kháng sinh; giữ ở nhiệt độ 370C, trong điều kiện vi hiếu khí 5% O2, 10% CO2, 85% N2, độ ẩm cao [110]. Ưu
điểm của phương pháp này ngồi xác định sự cĩ mặt của vi khuẩn cịn đánh giá độ nhạy cảm kháng sinh và phân tích đặc điểm, mối liên quan của chủng
H. pylori. Tại Việt Nam, nuơi cấy chưa được coi là thường quy chẩn đốn phịng xét nghiệm, do vậy bệnh nhân thường được điều trị khi chưa cĩ chẩn đốn xác định dương tính với H. pylori bằng nuơi cấy.
1.5.1.5. Phương pháp sinh học phân tử PCR (khuếch đại gien)
Nguyên lý của kỹ thuật là dùng phản ứng chuỗi polymerase chung với cặp mồi (primers) được thiết kế dựa trên một đoạn gien đặc hiệu của H. pylori
để khuếch đại nhiều lần và phát hiện vi khuẩn nếu chúng cĩ mặt trong bệnh phẩm. PCR được coi là kỹ thuật cĩ độ nhậy cao nhất trong việc phát hiện các vi khuẩn, PCR đạt độ nhậy và đặc hiệu tới 93% và 100% cho việc phát hiện
H. pylori. Các phương pháp sinh học phân tử như: phân tích đặc điểm plasmid, phân tích cắt đoạn các nuclease của ADN, Ribotyping, khuếch đại ngẫu nhiên đa hình (PCR- based RAPD - Random amplified polymorphic DNA), đa hình độ dài đoạn giới hạn (PCR- based RFLP - restriction fragment length polymorphism) đã được áp dụng cho việc nghiên cứu độc lực, cơ chế kháng thuốc, mối liên quan các chủng, lây truyền trong gia đình chẩn đốn xác định các chủng H. pylori [112]. Các kiểu gien CagA và VacA được xác định bằng phương pháp PCR trên các mẫu sinh thiết [113]. Tuy nhiên, phương pháp này cần nhiều trang thiết bị hiện đại, giá thành cao nên chưa được ứng dụng rộng rãi [110].
1.5.2. Các phương pháp khơng cần nội soi (non - invasive methods)
1.5.2.1. Test thở dùng cacbon phĩng xạ (Urea Breath Test - UBT)
Thử nghiệm thở urea sử dụng 13C hoặc 14C là một phương pháp chọn lọc để phát hiện nhiễm trùng H. pylori cấp tính trước và sau điều trị [46]. So với phương pháp mơ bệnh học test urease cĩ độ nhậy 94. 9% và độ đặc hiệu 100%, như vậy giá trị dương tính đúng 100% và âm tính đúng 96. 3%.
Do nhiễm trùng H. pylori thường mắc phải thời thơ ấu nên 13C - UBT được coi là phương pháp hữu ích cho tình trạng đánh giá nhiễm H. pylori ở trẻ em, đặc biệt nĩ dễ dàng nhận được sự chấp nhận của bệnh nhân và cĩ thể làm nhiều lần nếu được yêu cầu [114], đồng thời áp dụng được ở phụ nữ mang thai. Nhược điểm của UBT là dễ gây âm tính giả nếu trong khoảng thời gian 2-4 tuần trước đĩ người bệnh dùng một số thuốc như PPI, kháng sinh, Bismuth hoặc mật độ vi khuẩn quá thấp, hơn nữa để thực hiện UBT cần cĩ máy quang phổ kế - là thiết bị rất đắt tiền [115], và sự phối hợp thực hiện từ bệnh nhân, điều mà rất khĩ thực hiện đối với trẻ nhỏ.
1.5.2.2. Phương pháp phát hiện kháng nguyên trong phân
Bằng nghiên cứu đa phân tích đánh giá độ chính xác của test phát hiện kháng nguyên trong phân ở bệnh nhân người lớn, Gisbert và cs [116], đã tìm ra độ nhậy và độ đặc hiệu của test tương ứng là 94% và 97%. Test phân sử dùng kháng thể đơn dịng cũng đã được áp dụng chẩn đốn trên bệnh nhi ở Việt Nam và cũng đạt độ nhậy 94. 6% và độ đặc hiệu 94. 9% [117]. Ngồi giá trị chẩn đốn cao, test này cĩ ưu điểm là đơn giản, cĩ thể trả lời trong ngày và cĩ độ chính xác tương đương test thở [29]. Vì vậy nĩ được khuyến cáo dùng theo dõi kết quả điều trị diệt H. pylori khi khơng cĩ test thở.
1.5.2.3. Phát hiện nhiễm H. pylori bằng xét nghiệm nước bọt và nước tiểu
Do độ nhậy và độ đặc hiệu cịn thấp nên phương pháp này ít được sử dụng trong nghiên cứu. Tuy nhiên, chúng cĩ lợi điểm lớn là bệnh phẩm dễ lấy, khơng sang chấn cho bệnh nhân nên rất thuận lợi cho trẻ em [69]. Gần đây các tác giả người Nhật đã chế tạo thành cơng một loại test chẩn đốn H. pylori bằng cách phát hiện IgG kháng H. pylori trong nước tiểu với độ nhậy 94,4%, độ đặc hiệu 96,9%, giá trị dương tính 96%, dựa trên nguyên lý sắc ký miễn dịch với màng nitrocellulose phủ kháng nguyên H. pylori. Nghiên cứu nảy mở ra một triển vọng mới cho việc nghiên cứu nhiễm trùng này. Khơng
những dùng trong chẩn đốn lâm sàng mà cịn khảo sát trong nghiên cứu dịch tễ học trên một diện rộng ở trẻ em [118].
1.5.2.4. Phương pháp chẩn đốn huyết thanh học
* Kỹ thuật ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay)
ELISA được sử dụng rộng rãi trong chẩn đốn nhiễm trùng H. pylori
bằng phát hiện kháng thể H. pylori trong huyết thanh. Nĩ được coi như phương pháp đầu tiên trong số các phương pháp khơng xâm nhập được chọn lọc cho chẩn đốn H. pylori [110]. ELISA thực sự thuận tiện cho bệnh nhân (đặc biệt đối với bệnh nhi), dễ dàng thực hiện, rẻ tiền, khơng bị ảnh hưởng bởi việc lấy mẫu và đủ độ nhậy để phát hiện một số trường hợp mới nhiễm H. pylori. Hơn nữa, nĩ rất hữu ích cho việc đánh giá nhiễm trùng trên quy mơ lớn cũng như hỗ trợ cho nghiên cứu dịch tễ học nhiễm trùng H. pylori [119]. Ngồi ra, nĩ cũng cịn cĩ thể được dùng trong việc theo dõi đánh giá kết quả điều trị, nhưng kém nhậy hơn so với test thở 13C và 14C và cần theo dõi nhiều lần vì nồng độ kháng thể chỉ bắt đầu giảm sau 1 tháng kể từ khi vi khuẩn bị tiêu diệt. Nguyên lý của kỹ thuật này được thể hiện trong chính tên gọi của nĩ, kháng nguyên H. pylori đã được gắn sẵn lên các giếng của phiến nhựa để làm phản ứng. Sau khi cho huyết thanh bệnh nhân vào các giếng và ủ lần thứ nhất, kháng thể kháng H. pylori trong huyết thanh sẽ gắn với các kháng nguyên đặc hiệu. Tiếp đến kháng thể kháng người cĩ gắn enzym peroxydase được đưa vào sẽ gắn với phức hợp kháng nguyên - kháng thể kháng H. pylori
(nếu cĩ) ở lần ủ thứ hai. Khi cho thêm cơ chất của enzyme, nếu cĩ phức hợp kháng nguyên H. pylori - kháng thể kháng H. pylori gắn với kháng thể kháng người gắn enzym peroxydase thì phản ứng sẽ hiện màu. Trên thị trường hiện cĩ rất nhiều loại kit thương mại dùng để phát hiện kháng thể kháng H. pylori. Theo nguyên lý ELISA, độ nhậy và độ đặc hiệu của chúng dao dộng từ 60- 95%, trung bình là 88%. (bảng 3).
Bảng 1.5 Giá trị chẩn đốn của một số Kit ELISA thơng dụng [120] Loại kit Hãng Số bệnh nhân Độ nhậy % (TB) Đơ đặc hiệu % (TB)
Cobac core Roche 1. 538 93-99 (95) 77-97 (88)
Helicon –G Porton- Cambrige
1. 053 71-96 (82) 45-90 (70)
Malakit Biolab 308 87-96 (90) 79-96 (86)
Gap-IgG Bio –Rad 1. 077 77-100 (90) 26-91 (63)
Pylori-Stat Bio-Whittaker 963 90-99 (96) 70-98 (90)
HM-CAP Enteric Products 575 95-98 (97) 92-98 (93)
Premier HP OSI 209 87-93 (89) 81-96 (88)
Pyloriset-EIA G Orion 381 76-96 (91) 84-96 (86)
Huyết thanh chẩn đốn bằng ELISA thay đổi mức độ nhậy và đặc hiệu tùy theo việc sử dụng ở quần thể khác nhau do thiếu việc đánh giá các thử nghiệm tại các quần thể khi áp dụng ELISA [119]. Thơng thường nếu độ nhạy và độ đặc hiệu của phương pháp huyết thanh khơng đạt trên 90% thì khơng khuyến cáo sử dụng. Gần đây, với các kit huyết thanh thương mại, ELISA đã được sử dụng trong thường quy chẩn đốn phịng thí nghiệm cho các bệnh dạ dày - tá tràng. Các phương pháp ELISA cĩ thể cĩ độ đặc hiệu thấp do cĩ kết quả dương tính giả bởi hiện tượng phản ứng chéo khơng đặc hiệu với các vi khuẩn khác như Campylobacter SPP [121]. Rất nhiều loại kháng nguyên được sử dụng cho ELISA như urea, tách chiết glycine, siêu ly tâm tồn tế bào và dung dịch nuơi cấy tinh lọc. Đã cĩ rất nhiều loại kit huyết thanh chất lượng cho chẩn đốn H. pylori bao gồm cả kit in - house và kit thương mại được áp dụng rộng rãi. Tuy nhiên, bất kỳ loại kit ELISA nào cũng cần được đánh giá với một số lượng mẫu lớn trong một quần thể cần xác định [122]. Ở Việt Nam, phương pháp huyết thanh học (ELISA) đã được lượng giá từ năm 2003 và được sử dụng để đánh giá tỷ lệ lưu hành nhiễm trùng H. pylori. Thêm nữa, ELISA là phương pháp đánh giá gián tiếp và yêu cầu đánh giá huyết thanh 2 lần (để phát hiện sự thay đổi kháng thể trước và sau điều trị). Nếu đã đánh giá theo dõi điều trị cĩ kháng thể phát hiện các bệnh lý dạ dày hiện mắc và cũng
khơng phân biệt được tình trạng nhiễm trùng mới hay nhiễm từ trước đĩ [110]. Âm tính giả cĩ thể xảy ra ở các bệnh nhân mới nhiễm H. pylori khi đĩ nồng độ kháng thể cịn thấp chưa đủ để phát hiện được, ngược lại dương tính giả cĩ thể xảy ra ở các bệnh nhân đã điều trị khỏi nhưng nồng độ kháng thể trong cơ thể cịn hoặc giảm rất chậm [110]. Ngày nay, đại đa số các nghiên cứu điều tra dịch tễ học trên thế giới đều sử dụng kỹ thuật ELISA vì cĩ độ nhậy và độ đặc hiệu chấp nhận được, kỹ thuật đơn giản, dễ thực hiện khơng cần nội soi, ít sai sĩt kỹ thuật (nhất là so với test thở) và nhanh chĩng. Tuy nhiên vì cĩ nhiều loại sinh phẩm nên việc so sánh kết quả trở nên khĩ khăn. Tại Việt Nam, theo nghiên cứu của T. T. H Hồng và cs [123],[124], phương pháp ELISA in-house đã được phát triển và đánh giá cho các mục đích nghiên cứu lâm sàng và huyết thanh dịch tễ học. Phương pháp ELISA này, sử dụng kháng nguyên sản xuất bằng phương pháp siêu ly tâm tồn tế bào từ chủng vi khuẩn phân lập trên bệnh nhân viêm loét dạ dày người Việt nam. Để đánh giá độ nhạy và độ đặc hiệu của phương pháp, nhĩm tác giả đã phân tích huyết thanh được thu thập từ 91 bệnh nhân loét dạ dày, 158 bệnh nhân loét hành tá tràng đã được xác định H. pylori dương tính bằng phương pháp nuơi cấy, và 128 người khỏe mạnh khơng mang triệu chứng nhưng được xác định dương tính với H. pylori bằng thử nghiệm thở. Đồng thời huyết thanh nhĩm chứng tại cộng đồng được thu thập từ 971 người tình nguyện tại hai vùng Hà Nội và Hà Tây. Trong đĩ, 432 người lớn (18- 88 tuối) từ Hà Nội được tham gia cho nghiên cứu đánh giá huyết thanh học và 971 người cho nghiên cứu huyết thanh dịch tễ học. Phương pháp miễn dịch hấp phụ men dựa trên các chủng địa phương chỉ ra sự khác biệt cĩ ý nghĩa. Phương pháp này cũng cho thấy giá trị kháng thể cao hơn cĩ ý nghĩa ở bệnh nhân loét dạ dày tá tràng cĩ H. pylori
dương tính so với cá thể trong cộng đồng cĩ H. pylori dương tính. Việc sử dụng các kít huyết thanh thương mại đã chỉ ra độ tập trung kháng thể kháng
H. pylori trong cộng đồng người châu Á thấp hơn so với người châu Âu, điều này chứng tỏ một số kít thương mại khơng phù hợp cho cộng đồng châu Á. Vì
vậy, để ứng dụng đánh giá cho một cộng đồng, các kít cần được xác định cho thích hợp. Phương pháp miễn dịch hấp phụ men đã được điều chỉnh đã chỉ ra