Chẩn đốn huyết thanh học cho tất cả các đối tượng nghiên cứu trong quần thể (kể cả trẻ em, bố mẹ, ơng bà, cơ dì chú bác sống trong một nhà) bằng kỹ thuật ELISA in- house (phụ lục 4).
Lấy máu: sau khi lấy 5ml máu tĩnh mạch của đối tượng nghiên cứu, cho vào ống nghiệm khơng cĩ chất chống đơng, sau đĩ ly tâm tách huyết thanh với tốc độ 2.000 vịng/phút. Các huyết thanh được giữ ở -200C tại phịng xét nghiệm Trung tâm Y tế Dự phịng tỉnh Lâm Đồng. Sau đĩ trong vịng 1 tuần gửi về phịng xét nghiệm của viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương bằng đường hàng khơng để làm test ELISA xác định kháng thể IgG kháng H. Pylori.
* Nguyên liệu
- Bản nhựa 96 giếng đáy vuơng, hãng NUNC, Đan Mạch - Máy rửa bản ELISA
- Máy đọc ELISA, sử dụng bước sĩng 405nm
- Pipetteman loại 10µl, 20µl, 200µl, 1000µl, 5000µl
- Kháng nguyên: Kháng nguyên tổng hợp dùng với nồng độ 80µg /ml (H. pylori), 90 µg /ml (Campylobacter jejuni)
- Cộng hợp men kháng thể dê kháng IgG người - Huyết thanh bệnh nhân hoặc người lành - Dung dịch PBS (Phosphate buffered saline)
- BSA 1% (Bovine serum albumin, hãng Sigma, Mỹ) - Tween 20 (hãng Merck, Đức)
- Viên cơ chất pNPP và dung dịch đệm pha cơ chất (hãng Sigma)
- Kháng nguyên H. pylori đã được sử dụng: Kháng nguyên tồn thân vi khuẩn bất hoạt bằng siêu ly tâm từ 5 loại chủng H. pylori phân lập được trên bệnh nhân viêm hoặc loét dạ dày-tá tràng (Kháng nguyên này được sản xuất theo thường qui của Học viện Karolinska, Thụy Điển)
- Kháng nguyên Campylobacter jejuni được sản xuất từ các chủng bệnh nhân tiêu chảy người Việt Nam (theo thường qui của Học viện Karolinska, Thụy Điển)
- Chuẩn bị cho bản ELISA: Pha lỗng kháng nguyên H. pylori trong dung dịch PBS pH 7,4 theo nồng độ 80µg/ml. Nhỏ 100µl dung dịch kháng nguyên đã pha lỗng vào trong từng giếng của bản ELISA. Phủ kín bản bằng giấy bạc và giữ ở nhiệt độ phịng qua đêm.
- Chuẩn bị các dung dịch đệm: Dung dịch gắn bản: PBS pH 7,4.
Dung dịch pha lỗng huyết thanh: PBS-BSA 1%-Tween 20
PBS-BSA 1%-Tween 20 và kháng nguyên Campylobacter jejuni
Dung dịch rửa bản: PBS-Tween 20
Dung dịch cơ chất: Chỉ chuẩn bị trước khi dùng 5 phút theo tỷ lệ 1 viên cơ chất trong 5ml dung dịch cơ chất (tránh ánh sáng).
- Huyết thanh bệnh nhân được pha lỗng 1:100 trong dung dịch đệm PBS-BSA 1%-Tween 20, sau đĩ tiếp tục pha lỗng 1:10 trong PBS bao gồm 90 µg/ml của kháng nguyên Campylobacter jejuni để tránh phản ứng chéo giữa các kháng thể.
- Nhỏ 100µl dung dịch huyết thanh đã pha lỗng vào trong từng lỗ của bản nhựa đã gắn kháng nguyên H. pylori. Ủ bản nhựa 1giờ ở 370C.
Sử dụng hai chứng dương và hai chứng âm (chuẩn quốc tế). Mỗi mẫu huyết thanh được làm đúp trên một bản nhựa.
- Nhỏ 100µl dung dịch kháng thể dê kháng IgG người đã được pha lỗng theo tỉ lệ 1:2500 vào từng lỗ trên bản nhựa. Tiếp tục ủ trong 1 giờ ở 370C.
- Rửa bản nhựa 3 lần bằng dung dịch PBS - Tween 20, pH =7.
- Nhỏ 100µl dung dịch cơ chất vào từng lỗ của bản nhựa. Dùng hàng đầu tiên của bản nhựa chỉ nhỏ dung dịch cơ chất để làm hàng chứng cho phản ứng trong ngày. Tiếp tục ủ bản nhựa 15 phút ở 370C hoặc 30 phút ở nhiệt độ phịng.
- Đọc kết quả phản ứng bằng máy ELISA với bước sĩng 405nm.
* Đánh giá kết quả:
Giá trị 0,2 là giới hạn đánh giá kết quả dương tính hay âm tính của phương pháp. Giá trị này đã được xác định từ nghiên cứu của Hồng Thị Thu Hà và cs [125], trong đĩ chuẩn vàng là sự hợp các phương pháp CLO, mơ bệnh học, nuơi cấy, ELISA của chủng H. pylori dương tính được nuơi cấy từ 124 bệnh nhân loét dạ dày- tá tràng và 200 người lành, với độ nhạy cảm 100% (124/124) và độ đặc hiệu 96% (192/200).
Hình 2.1. Quy trình xét nghiệm ELISA
Hình 2.2. Pipette lấy máu tách chiết huyết thanh
Hình 2.4. Máy đọc kết quả