Phương pháp nội soi được áp dụng từ những năm của thập kỷ 70, được thực hiện bởi Warren và Marshall khi kiểm tra tồn bộ dạ dày và lấy mảnh sinh thiết để phục vụ chẩn đốn phát triển sự cĩ mặt của H. pylori. Để cĩ kết quả tối ưu cần tuân thủ những nguyên tắc cơ bản khi lấy mẫu sinh thiết [109].
1.5.1.1. Phương pháp chẩn đốn tế bào học
Là phương pháp soi tìm vi khuẩn H. pylori trực tiếp từ mẫu sinh thiết phết trên lam kính và nhuộm theo cách thơng thường (Gram, Giemsa hoặc Fucxin) hoặc soi kính hiển vi đối quang phân kỳ. Độ nhậy của phương pháp này là 75-85% độ đặc hiệu giống như trong xét nghiệm mơ bệnh học [110].
1.5.1.2. Phương pháp chẩn đốn mơ bệnh học
Phương pháp mơ bệnh học được coi là phương pháp chuẩn vàng nếu khơng cĩ điều kiện nuơi cấy vi khuẩn. Nhuộm HE và Giemsa được sử dụng thường quy vì rẻ tiền, đơn giản dễ thực hiện, nhưng độ nhạy khơng cao (33- 90% tùy kinh nghiệm người đọc). Các phương pháp nhuộm Giemsa - Romanowsky cải tiến và nhất là các phương pháp nhuộm bạc (Dieterle, warthin-starry, steiner, Gienta) cĩ độ nhạy trên 90%. Gần đây phương pháp hĩa mơ miễn dịch (Immunohistochemical) dùng kháng thể đặc hiệu kháng H. pylori cĩ độ nhậy rất cao nhưng tốn kém nên ít sử dụng rộng rãi. Nhiều nhà nghiên cứu đã lấy nĩ làm xét nghiệm quy chiếu để đánh giá độ nhậy và độ đặc hiệu của phương pháp khác [110]. Tại Việt Nam, phương pháp nhuộm
Giemsa và Hematoxylin - Eosin (HE) thường được sử dụng để phát hiện sự cĩ mặt của vi khuẩn.
1.5.1.3. Phương pháp phát hiện urease của H. pylori trong mảnh sinh thiết
Nguyên lý của phương pháp này dựa trên đặc điểm sinh học của H. pylori cĩ hệ men urê rất phong phú nhanh chĩng phân hủy urê thành ammoniac và bicarbonate làm mơi trường trở nên kiềm hĩa và làm thay đổi chỉ thị màu cĩ trong ống nghiệm.
Urê Ammoniac + Bicarbonate (NH2)2CO2 + 2H2O+ H+ urease 2NH4+ + HCO-
3
Nguyên lý test urease (theo Bruleydes vanes, 1997)
Độ nhạy của thử nghiệm phụ thuộc vào số lượng vi khuẩn trong mẫu bệnh phẩm, chính vì vậy nĩ cĩ thể sử dụng để đánh giá sàng lọc sau điều trị thất bại [111]. Độ nhạy 90%, độ đặc hiệu 100% khi đọc kết quả sau 10 phút. Tuy nhiên, phản ứng dương tính giả cĩ thể xảy ra do nhiễm với vi khuẩn sinh urease ở khoang miệng (sau 24 giờ) hoặc bệnh nhân đã dùng thuốc ức chế bơm proton [111]. Từ 2003, tại Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương Việt Nam các nhà nghiên cứu đã sử dụng cơng thức tự chế, với thời gian được kết quả tối đa sau 5 phút đạt độ đặc hiệu của test là 98% trong nghiên cứu quần thể bệnh nhân loét dạ dày tá tràng tại Việt Nam.
1.5.1.4. Phương pháp nuơi cấy vi khuẩn
Nuơi cấy vi khuẩn dương tính được coi là tiêu chuẩn vàng. Tỷ lệ nuơi cấy H. pylori từ mảnh sinh thiết đạt từ khoảng 50% đến 70% và cịn tùy thuộc vào kinh nghiệm, khả năng của các phịng thí nghiệm. Mơi trường nuơi cấy
H. pylori là mơi trường chuyên biệt như pylori agar, shirrow cải tiến hoặc mơi trường cĩ 5-7% máu ngựa hoặc cừu như mơi trường Columbia, Burcella, BHI cho thêm các yếu tố giàu dinh dưỡng và kháng sinh; giữ ở nhiệt độ 370C, trong điều kiện vi hiếu khí 5% O2, 10% CO2, 85% N2, độ ẩm cao [110]. Ưu
điểm của phương pháp này ngồi xác định sự cĩ mặt của vi khuẩn cịn đánh giá độ nhạy cảm kháng sinh và phân tích đặc điểm, mối liên quan của chủng
H. pylori. Tại Việt Nam, nuơi cấy chưa được coi là thường quy chẩn đốn phịng xét nghiệm, do vậy bệnh nhân thường được điều trị khi chưa cĩ chẩn đốn xác định dương tính với H. pylori bằng nuơi cấy.
1.5.1.5. Phương pháp sinh học phân tử PCR (khuếch đại gien)
Nguyên lý của kỹ thuật là dùng phản ứng chuỗi polymerase chung với cặp mồi (primers) được thiết kế dựa trên một đoạn gien đặc hiệu của H. pylori
để khuếch đại nhiều lần và phát hiện vi khuẩn nếu chúng cĩ mặt trong bệnh phẩm. PCR được coi là kỹ thuật cĩ độ nhậy cao nhất trong việc phát hiện các vi khuẩn, PCR đạt độ nhậy và đặc hiệu tới 93% và 100% cho việc phát hiện
H. pylori. Các phương pháp sinh học phân tử như: phân tích đặc điểm plasmid, phân tích cắt đoạn các nuclease của ADN, Ribotyping, khuếch đại ngẫu nhiên đa hình (PCR- based RAPD - Random amplified polymorphic DNA), đa hình độ dài đoạn giới hạn (PCR- based RFLP - restriction fragment length polymorphism) đã được áp dụng cho việc nghiên cứu độc lực, cơ chế kháng thuốc, mối liên quan các chủng, lây truyền trong gia đình chẩn đốn xác định các chủng H. pylori [112]. Các kiểu gien CagA và VacA được xác định bằng phương pháp PCR trên các mẫu sinh thiết [113]. Tuy nhiên, phương pháp này cần nhiều trang thiết bị hiện đại, giá thành cao nên chưa được ứng dụng rộng rãi [110].