PHẦN 3 VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.3.1. Đánh giá khả năng thích nghi của các mẫu giống hồng hoa trồng tại Hà
Nội dung 2: Nghiên cứu chọn lọc giống hồng hoa có tiềm năng năng suất, đạt chất lượng theo tiêu chuẩn Dược điển và khả năng thích hợp với điều kiện sinh thái miền Bắc.
3.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.3.1. Đánh giá khả năng thích nghi của các mẫu giống hồng hoa trồng tại Hà Nội Hà Nội
Bố trí thí nghiệm:
- Đánh giá tỷ lệ nảy mầm trong phòng:Mẫu hạt giống được đặt trong đĩa petri được lót giấy thấm. Mỗi mẫu được thử với 5 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc được tiến hành với 50 hạt. Sau đó đĩa petri được đặt trong tủ vi khí hậu với nhiệt độ được duy trì ở mức 250C và luôn đảm bảo đủ ẩm 70%. Theo dõi nảy mầm hạt và tính tỷ lệ nảy mầm (%).
- Đánh giá tỷ lệ này mầm ngoài đồng ruộng: Hạt giống được tiến hành gieo trên vườn ươm trong điều kiện mùa vụ thích hợp. Mỗi mẫu hạt được gieo với 5 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại tiến hành gieo 100 hạt. Theo dõi số hạt này mầm và tính tỷ lệ mộc mầm (%).
- Thí nghiệm ngoài đồng ruộng được tiến hành đối với 3 mẫu giống hồng hoa, mỗi mẫu giống là một công thức, được bố trí với 5 lần nhắc lại/mẫu. Diện tích mỗi ô thí nghiệm là 20 m2. Thí nghiệm không có đối chứng do hiện không có giống hồng hoa được sản xuất tại Việt Nam
Kỹ thuật trồng, chăm sóc, thu hái dược liệu: + Thời vụ gieo hạt: 15/10 đến 30/10.
+ Hạt giống sạch, không bị lẫn tạp được gieo trong vườn ươm trước khi trồng trên ruộng thí nghiệm. Sau khi gieo, tưới nước thường xuyên đảm bảo đủ ẩm. Cây con thường bị sâu bệnh phá hoại nên cần chú ý để phòng trừ kịp thời.
Đất cày, làm nhỏ và lên luống cao 30-35 cm, rộng 70 cm, bón lót phân chuồng 15 tấn/ha. Khoảng cách trồng 30 x40 cm.
+ Tưới nước cho cây đảm bảo độ ẩm cho cây sinh trưởng và phát triển, bón thúc 3 đợt, sau trồng 1,5 tháng, sau trồng 3 tháng và khi cây bắt đầu ra hoa.
+ Xới xáo và vun gốc khi cây cao 30-35 cm. Làm giàn chống đổ cho cây khi cây cao 40 – 50 cm, giàn làm theo kiểu giàn hình chữ A.
+ Khi cánh hoa chuyển từ mầu vàng sang mầu đỏ thu hoach quả, tách phần hạt riêng với cánh hoa. Dược liệu cánh hoa được phơi khô trong nắng tự nhiên hoặc sấy trong tủ sấy ở nhiệt độ 50oC. Sau đó, dược liệu cánh hoa được bảo bản trong tủ lạnh ở 4oC đến khi phân tích chất lượng.
Các chỉ tiêu theo dõi
Tiến hành theo dõi định kì 15 ngày/lần, mỗi lần nhắc lại đo đếm trên 10 cây. + Tỷ lệ nảy mầm (%): Được tính theo công thức
+ Thời gian mọc mầm (ngày): tính từ lúc gieo đến khi có 50% hạt mọc mầm. + Thời gian từ gieo đến khi ra lá thật (ngày): tính từ lúc gieo đến khi có 50% cây con có 2 lá thật.
+ Thời gian từ trồng đến ra hoa đầu (ngày): Tính từ lúc trồng đến khi có 50% cây ra hoa đầu tiên.
+ Thời gian từ trồng đến khi bắt đầu thu hoạch (ngày): Tính từ lúc trồng đến khi thu hoạch dược liệu.
+ Chiều cao cây (cm): Đo từ vị trí sát mặt đất đến đỉnh vuốt lá cao nhất. + Số lá trung bình trên cây: lá/cây.
+ Số cành cấp 1/cây.
+ Số hoa/cây (bông): Đếm tổng số hoa trên cây. + Số quả/cây (quả): Đếm tổng số quả trên cây.
+ Số hạt chắc/quả (hạt): Đếm tổng số hạt chắc trên quả chín. + Khối lượng 1000 hạt (g): Đếm 1000 hạt rồi cân khối lượng.
+ Năng suất cá thể (g): Được tính là khối lượng dược liệu khô thu được trên mỗi cá thể.
+ Năng suất thực thu (kg/ha): thu toàn bộ hoa trên toàn bộ diện tích mỗi lần nhắc lại sau đó phơi khô và cân khối lượng thu được.
Trong đó: NSCT: Năng suất cá thể (g) M: Mật độ cây/ha
Đánh giá tình hình sâu bệnh hại trên các giống hồng hoa nhập nội trồng tại Thanh Trì – Hà Nội
Điều tra sâu hại: Theo phương pháp điều tra tự do, thu thập tất cả những loài sâu hại (Viện bảo vệ thực vật, 1997). Xác định các loài sâu hại và mức độ bắt gặp của chúng theo công thức: Độ bắt gặp (%) = (số điểm điều tra bắt gặp loài sâu hại: tổng số điểm điều tra) x 100%
Mức độ hiện diện của sâu hại được xếp ở các mức sau: (-): Rất ít gặp hay hiếm gặp, độ bắt gặp <5%;
(+): Ít gặp, độ bắt gặp từ trên 5% đến 20%;
(++): Gặp trung bình, độ bắt gặp từ trên 20% đến 50%; (+++): Gặp nhiều, độ bắt gặp trên 50%.
- Điều tra bệnh hại: Quan sát các triệu chứng trên cây trồng trong sản xuất, định tỉ lệ bệnh và thu thập mẫu đưa về phòng thí nghiệm để phân loại, giám định.
Xác định mức độ phổ biến của bệnh theo thang 4 cấp sau (Đặng Vũ Thị Thanh và Hà Minh Trung, 1997):
(+) : rất ít phổ biến (< 10% cây hoặc lá bị bệnh); (++) : ít phổ biến (11– 25 % cây hoặc lá bị bệnh); (+++) : Phổ biến (26 – 50 % cây hoặc lá bị bệnh); (++++) : Rất phổ biến ( >50 % cây hoặc lá bị bệnh).
- Phương pháp giám định sâu và động vật hại: Các mẫu sâu và động vật hại thu về một phần được xử lý mẫu ướt, một phần làm mẫu khô để phân loại, một phần được nuôi tiếp để xác định loài. Các mẫu trưởng thành của bộ cánh vảy và cánh cứng được bảo quản bằng cách căng và sấy trong tử sấy ở nhiệt độ 600C trong 3-4 ngày, sau đó đưa vào hộp mẫu gỗ để định loại. Các loài trưởng thành thuộc bộ cánh thẳng, cánh nửa và sâu non, nhộng thuộc bộ cánh vảy cùng các loài thiên địch ký sinh được sơ chế rồi bảo quản trong các dung dịch bảo quản côn trùng (Viện Bảo vệ thực vật, 1997).
- Phân lập và giám định nấm gây bệnh: Mẫu bệnh điển hình sau khi thu thập về, loại bỏ phần lá và rửa sạch dưới vòi nước. Cắt bộ phận bị bệnh thành những miếng nhỏ sao cho miếng cắt nằm ở ranh giới giữa mô bệnh và mô khỏe. Khử trùng miếng cắt bằng ethanol 700 trong 5 giây, sau đó rửa sạch bằng nước cất vô trùng. Thấm khô miếng cắt thành miếng nhỏ 5x5mm và cấy lên môi trường PDA. Khi nấm đã phát triển với kích thước đường kính tản nấm 1-2cm, cấy truyền sang môi trường WA. Nấm được làm thuần bằng cách cấy đỉnh sinh trưởng của sợi nấm từ môi trường WA sang môi trường PDA và CLA (Burgess
et al., 2008). Các mẫu nấm được nuôi trong phòng thí nghiệm ở điều kiện 25oC. Sau 7 ngày, nấm được giám định dựa vào hình thái quan sát dưới kính hiển vi (Banerr and Hunter, 1998).
Đánh giá chất lượng dược liệu của các giống hồng hoa nhập nội
Các chỉ tiêu đánh giá chất lượng dược liệu các mẫu hồng hoa theo Dược điển quy định gồm có: Định tính dược liệu, độ ẩm dược liệu, tro toàn phần dược liệu và định lượng hoạt chất chính là Hydroxysafflor yellow A và Kaempferol. Dược liệu là cánh hoa được thu khi cánh hoa bắt dầu chuyển từ mầu vàng sang mầu đỏ như mô tả bởi Dược điển Việt Nam IV (2009) và Dược điển Trung Quốc (2010).
Phân tích định tính
Phân tích định tính dược liệu được thực hiện bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC) theo Dược điển Việt Nam IV (2009).
Mẫu thử được chấm so sánh với các dung dịch dược liệu hồng hoa đối chiếu của Viện Dược liệu, và so sánh với các chất đối chiếu sau: Hydroxysafflor yellow Avà Kaempferol. Điều kiện tiến hành sắc ký lớp mỏng như sau:
- Bản mỏng: Silica gel 60 F254
- Dung môi triển khai: ethyl acetat: acid fomic: nước: methanol (7:2:3:0,4). Sau khi triển khai sắc ký, lấy bản mỏng ra, để khô trong không khí và phun thuốc thử boric oxalic. Quan sát sắc ký đồ UV 366 nm (trước và sau khi phun thuốc thử).
Phân tích độ ẩm: Độ ẩm của dược liệu được xác định theo phương pháp được mô tả tại phụ lục 12.13 của Dược điển Việt Nam IV (2009).
Phân tích tro toàn phần:Hàm lượng tro toàn phần của dược liệu được tiến hành theo phương pháp được mô tả ở phụ lục 9.8 của Dược điển Việt Nam IV (2009).
Định lượng hydroxysafflor yellow A và kaempferol có trong dược liệu hồng hoa
Chất lượng dược liệu hồng hoa được xác định bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) theo Dược điển Trung Quốc (2010). Chất lượng dược liệu hồng hoa được xác định bằng so sánh nồng độ các chất Hydroxysafflor yellow A và Kaempferol trong dược liệu với nồng độ chuẩn trong dược điển. Chất lượng được liệu hồng hoa đạt chất lượng khi nồng độ của chúng không thấp hơn nồng độ quy định trong Dược điển.
Định lượng hydroxysafflor yellow A trong dược liệu hồng hoa:
Chuẩn bị mẫu Hydroxysafflor yellow A (HSFA) đối chiếu: cân chính xác khoảng 5 mg mẫu chất, hoà tan trong chính xác 5 ml methanol/nước (1/4), thu được dung dịch mẫu HSFA đối chiếu có nồng độ khoảng 1 mg/ml. Từ dung dịch này, tiến hành pha loãng với các hệ số pha loãng khác nhau để thu được các dung dịch xây dựng đường chuẩn.
Chuẩn bị mẫu thử: cân chính xác khoảng 0,4 (g) dược liệu Hồng hoa đã tán nhỏ, sấy khô và xác định độ ẩm. Chuyển vào bình tam giác 50 ml, thêm khoảng 25 ml methanol/nước (1/4), siêu âm trong 30 phút, lọc vào bình định mức 50 ml. Thêm tiếp 20 ml methanol/nước (1/4) vào bã, siêu âm tiếp trong 20 phút, lọc tiếp vào bình định mức 50 ml trên. Bổ sung bằng methanol/nước (1/4) đến vạch mức, thu được dung dịch mẫu thử có nồng độ chính xác khoảng 2 mg/ml.
Phân tích hoạt chất Hydroxysafflor yellow A
Hydroxysafflor yellow A được định lượng trên hệ thống máy sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC), hãng Shimadzu, Nhật Bản. Sử dụng cột C18, hệ dung môi Acetonitril (B) – H3PO4 0,05 % (A). Tốc độ dòng: 0,4 ml/phút, ở bước sóng UV: 403 nm. Chương trình rửa giải như sau:
Thời gian (phút) B (%) A (%) Kiểu rửa giải 0 - 30 0 – 100 100 - 0 Gradient 30 - 40 100 0 Đẳng dòng
Định lượng kaempferol có trong dược liệu hồng hoa:
Chuẩn bị mẫu Kaempferol đối chiếu: cân chính xác khoảng 5 mg mẫu chất, hoà tan trong chính xác 5 ml methanol thu được dung dịch mẫu Kaempferol đối chiếu có nồng độ khoảng 1 mg/ml. Từ dung dịch này, tiến hành pha loãng với các hệ số pha loãng khác nhau để thu được các dung dịch có nồng độ khác nhau để xây dựng đường chuẩn.
Chuẩn bị mẫu thử: cân chính xác khoảng 0,5 (g) dược liệu Hồng hoa đã tán nhỏ, sấy khô và xác định độ ẩm. Chuyển vào bình cầu có dung tích 100 ml, thêm khoảng 25 ml methanol, chiết hồi lưu ở 700C trong 60 phút. Để nguội, cân và bổ sung bằng methanol đến khối lượng ban đầu. Lọc để thu được dịch lọc. Lấy chính xác 15,0 ml dịch lọc, thêm 5 ml acid hydrochloric (15 % - 37 %) vào, trộn đều, đun hồi lưu để thủy phân trong 30 phút, làm lạnh, chuyển vào bình định mức 25 ml trên. Bổ sung bằng methanol đến vạch mức, thu được dung dịch mẫu thử.
Phân tích hoạt chất kaempferol:
Kaempferol được định lượng trên hệ thống máy sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) của hãng Shimadzu, Nhật Bản sản xuất. Sử dụng cột C18, hệ dung môi Acetonitril (B) – H3PO4 0,01 % (A). Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút, ở bước sóng UV: 265 nm. Chương trình rửa giải như sau:
Thời gian (phút) B (%) A (%) Kiểu rửa giải 0 - 3 10 – 30 90 – 70 Gradient 3 - 8 30 – 50 70 – 50 Gradient 8 – 20 50 – 70 50 – 30 Gradient 20 - 30 70 – 100 30 – 0 Gradient 30 – 40 100 0 Đẳng dòng 40 Stop