4.2.1.3. Mật độ khuẩn lạc cầu trong nhân giống dạng dung dịch
Trong q trình nhân và ni giống dạng dịch thể, mật độ khuẩn lạc cầu cũng là một trong những chỉ tiêu quan trọng để đánh giá chất lượng giống dịch
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6 48H 72H 96H 120H 144H ĐT1 ĐT2 ĐT3 ĐT4 ĐT5
thể nói chung. Chỉ tiêu này phụ thuộc và nhiều yếu tố khác nhau như: Kích thước và tỷ lệ giống cấy ban đầu, dinh dưỡng môi trường nuôi cấy, độ pH của dung dịch nuôi cấy, tốc độ lắc cũng như cường độ sục khí ảnh hưởng nhiều đến kích thước cũng như mật độ KLC. Theo nghiên cứu của Ngô Xuân Nghiễn và Nguyễn Thị Bích Thùy (2016), về nhân giống dạng dịch thể chủng nấm chân dài, kết quả chỉ ra rằng trong giới hạn cho phép chế độ cấp khí càng cao thì mật độ KLC càng nhiều, sinh khối sợi càng tăng, chế độ sục khí q mạnh thì sinh khối sợi lại giảm, do tốc độ cao tạo ra lực cắt lớn làm giảm sự tăng trưởng của sợi nấm. Để phá thúc đẩy tăng trưởng của sợi nấm thì giống cần được phá vỡ dạng viên mịn, nhưng mặt khác sự cân bằng giữa tăng trưởng và phân đoạn sợi nấm cũng phải phù hợp nếu không sẽ ức chế sinh trưởng của hệ sợi (Marquez et al., 1999).
Bảng 4.8. Mật độ khuẩn lạc cầu của 5 chủng C. militaris trong môi trường dịch thể qua các giai đoạn
Chủng nấm
Thời gian sau cấy giống
48 giờ 72 giờ 96 giờ 120 giờ 144 giờ
ĐT1 + + + + + + + + + + + ĐT2 + + + + + + + + + + + ĐT3 + + + + + + + + + + + + + + + ĐT4 + + + + + + + + + + + + + + + ĐT5 + + + + + + + + + + + Ghi chú: - Số lượng KLC từ 10 – 40 có trong 1 ml dịch: (+) - Số lượng KLC từ 41 – 80 có trong 1 ml dịch: (++) - Số lượng KLC từ 81 – 120 có trong 1 ml dịch: (+++) - Số lượng KLC từ 121 – 150 có trong 1 ml dịch: (++++) - Số lượng KLC trên 150 có trong 1 ml dịch: (+++++)
Qua Bảng 4.8, nhận thấy trong giai đoạn đầu nhân giống mật độ KLC trong dung dịch giống của cả 5 chủng đều rất thấp kết quả này cũng phù hợp với kết nhận được trong Bảng 4.6 và Bảng 4.7 đó là khi mới cấy giống thì kích thước KLC cịn nhỏ, sinh khối sợi trong dịch giống còn thấp nên mật độ KLC cũng rất ít (+ đến + +) tương ứng với số KLC có trong dung dịch giống 10 – 80 KLC/ml. Tuy nhiên các giai đoạn sau đó thì mật độ KLC cũng tăng lên nhanh chóng cho đến 144h sau cấy có hai chủng ĐT3, ĐT4 đã đạt mật độ tối đa (+ + + + +) tương ứng với số lượng KLC > 150 KLC/ml khi nuôi trong môi trường dung dịch dinh dưỡng SDAY khơng có Agar và bổ sung thêm 5% dịch chiết nhộng tằm.
4.2.2. Tỷ lệ nhiễm bệnh
Giống dịch thể có mơi trường giàu dưỡng chất, thao tác cấy khá phức tạp, kỹ thuật cao, mơi trường khơng khí ở Việt Nam có độ ẩm cao, nhiệt độ cao rất phù hợp cho các vi sinh vật có hại gây bệnh cho nấm xâm hại và lây nhiễm từ khâu nhân giống. Qua đánh giá tỷ lệ nhiễm bệnh của dịch giống C. militaris cho kết quả Bảng 4.9 như sau: Các chủng nghiên cứu đều bị nhiễm khuẩn với các mức độ khác nhau cao nhất vẫn là hai chủng ĐT1, ĐT2 với tỷ lệ nhiễm lên đến 13,3% , ba chủng cịn lại ĐT3, ĐT4, ĐT5 có tỷ lệ nhiễm khuẩn 6,7%. Nấm men gây hại cho chủng ĐT4 với tỷ lệ gây hại là 6,7% các chủng khác không bị nhiễm. Tương tự như vậy nấm Mốc đen gây bệnh cho giống dịch của chủng ĐT2 là 13,3%. Mốc xanh gây hại cho hai chủng ĐT1, ĐT5 với tỷ nhiễm bệnh giống nhau là 6,7%.
Bảng 4.9. Tỷ lệ nhiễm bệnh của 5 chủng C. militaris trong môi trường nhân giống dạnh dịch thể
ĐVT: %
Chủng nấm Nhiễm khuẩn Nấm men Mốc xanh Mốc đen
ĐT1 13,3 0 6,7 0
ĐT2 13,3 0 0 13,3
ĐT3 6,7 0 0 0
ĐT4 6,7 6,7 0 0
ĐT5 6,7 0 6,7 0
Hình 4.6. Tỷ lệ nhiễm bệnh của 5 chủng nấm C. militaris trong môi trường nhân giống cấp trung gian dạng dịch thể
0 2 4 6 8 10 12 14 ĐT1 ĐT2 ĐT3 ĐT4 ĐT5 Nhiễm khuẩn Nấm men Mốc xanh Mốc đen
4.2.3. Đặc điểm hình thái dung dịch giống của 5 chủng nấm C. militaris trong môi trường nhân giống dạng dịch thể môi trường nhân giống dạng dịch thể
Màu sắc của môi trường nhân giống dung dịch màu sắc được tạo ra do màu của các chất dinh dưỡng bổ sung vào thành phần của mơi trường qua q trình khử trùng ở nhiệt độ cao sẽ tạo ra những màu sắc đặc trưng cho từng công thức môi trường khác nhau. Trong nghiên cứu này do mơi trường có sự tham gia của pepton cung cấp nguồn nitơ, đường Glucose cung cấp cacbon và các hợp chất vơ cơ bổ sung dinh dưỡng khống khác. Cho nên mơi trường sau hấp khử trùng xong có màu nâu đậm của q trình caramel hóa, dịch giống màu nâu đậm nhưng rất trong tiện quan sát trong quá trình ni giống.
Khi quan sát màu sắc và độ đặc của dịch giống qua các giai đoạn nuôi khác nhau cho kết quả như trong Bảng 4.10.
Bảng 4.10. Màu sắc và độ đặc dung dịch giống của 5 chủng nấm C. militaris trong môi trường nhân giống dịch thể qua các giai đoạn
Chỉ tiêu
Chủng nấm
Thời gian sau cấy giống
48 giờ 72 giờ 96 giờ 120 giờ 144 giờ
Mầu sắc
ĐT1 Nâu đậm Nâu Nâu sáng Nâu nhạt Trắng ĐT2 Nâu đậm Nâu Nâu sáng Nâu nhạt Trắng ĐT3 Nâu đậm Nâu Nâu sáng Nâu nhạt Trắng ĐT4 Nâu đậm Nâu Nâu sáng Nâu nhạt Trắng ĐT5 Nâu đậm Nâu Nâu sáng Nâu nhạt Trắng
Độ đặc
ĐT1 Loãng Loãng Huyền phù Huyền phù Đặc ĐT2 Loãng Loãng Huyền phù Huyền phù Đặc ĐT3 Loãng Loãng Huyền phù Huyền phù Đặc ĐT4 Loãng Loãng Huyền phù Huyền phù Đặc ĐT4 Loãng Loãng Huyền phù Huyền phù Đặc ĐT5 Loãng Loãng Huyền phù Huyền phù Đặc
Như vậy, màu sắc của dung dịch giống nấm được biến đổi theo sự tăng lên của kích thước KLC cũng như sinh khối sợi bên trong, trong các giai đoạn khi mới cấy giống được 48 giờ do sinh khối sợi nấm chưa nhiều nên dung dịch có mầu nâu đậm của mơi trường và dịch lỗng, sang giai đoạn 72h sau cấy do sinh khối sợi tăng nên dịch có màu nâu, nhưng do sinh khối sợi chưa đủ lớn nên dung dịch vẫn có dạng nước lỗng.
Sang giai đoạn tuổi giống đạt 96h thì màu sắc và tính chất vật lý của dung dịch đã thay đổi: màu nâu nhạt dần đi, dịch có dạng huyền phù do sự tăng lên của sinh khối sợi hai tính chất này tiếp tục biến đổi khi tuổi giống được 144h, lúc này sinh khối sợi rất lớn chiếm gần như toàn bộ dịch giống làm cho dịch trở lên rất đặc và màu dịch giống gần như có màu của hệ sợi nấm, màu nâu của môi trường cịn lại rất ít và mất dần thay thế vào đó là màu của hệ sợi nấm.
Môi trường nuôi cấy đông trùng hạ thảo là mơi trường giàu dinh dưỡng, diện tích bề mặt mơi trường rộng độ thơng thống và độ ẩm cao nên là điều kiện lý tưởng cho vi khuẩn cũng như các loại nấm bệnh xâm nhiễm, do đó kích thước KLC của chủng giống nhỏ, tỷ lệ đồng đều cao, dịch giống dạng huyền phù sẽ thuận lợi trong việc cấy chuyển vào môi trường nuôi trồng, giúp cho giống nấm phân bố đều trên bề mặt cơ chất, khả năng xâm chiếm bề mặt nhanh hạn chế được sự lẫn tạp của vi khuẩn và các lồi nấm bệnh khác trong q trình ươm sợi. Với những đặc thù và yêu cầu nhất định như vậy sẽ giúp cho sản xuất chọn ra được bình giống dịch C. militaris đạt yêu cầu để đưa vào sản xuất.
4.3. SINH TRƯỞNG, PHÁT TRIỂN, NĂNG SUẤT VÀ CHẤT LƯỢNG DƯỢC LIỆU CỦA 5 CHỦNG NẤM ĐÔNG TRÙNG HẠ THẢO CORDYCEPS MILITARIS TRONG NUÔI TRỒNG NHÂN TẠO
Khác với lồi C. sinensis khơng ni trồng được hồn chỉnh để tạo quả thể trong môi trường nhân tạo, nấm C. militaris có vịng đời hồn chỉnh khi ni cấy trong môi trường nhân tạo, và do sản lượng nấm này trong tự nhiên không đáng kể nên không đáp ứng được nhu cầu tiêu dùng hiện nay, do đó những năm gần đây có nhiều nghiên cứu trên việc nuôi cấy quy mô lớn quả thể để ứng dụng trong nghành công nghiệp dược liệu và thực phẩm chức năng (Gu et al., 2007).
Để sản xuất quy mô lớn về số lượng quả thể nấm C. militaris hiện nay
người ta sử dụng mơi trường rắn có chứa các hợp chất hữu cơ và có bổ sung thêm bột nhộng tằm B. mori hoặc nuôi trực tiếp trên ấu trùng tằm B. mori. Tuy nhiên, việc nuôi cấy quả thể trên côn trùng rất tốn kém, năng suất thập, tỷ lệ thành công khơng cao do bị nhiễm tạp, chi phí thiết bị nhà xưởng lớn. Do đó hiện nay nấm chủ yếu được ni trồng trên mơi trường có thành phần chính là gạo lứt, bổ sung thêm dung dịch dinh dưỡng.
Trong nghiên cứu này tơi tiến hành thí nghiệm đánh giá khả năng sinh trưởng, phát triển hệ sợi và hình thành quả thể nấm đơng trùng hạ thảo trên môi trường nuôi trồng nhân tạo. Cơng thức mơi trường có sử dụng gạo lứt là thành phần cơ chất chính trong ni trồng nấm Cordyceps militaris, là nguồn cung cấp
carbon cho sinh trưởng hệ sợi, hình thành và phát triển quả thể nấm Cordyceps
militaris. Sử dụng cao nấm men, pepton, dịch chiết nhộng tằm là nguồn cung cấp
nitơ hữu cơ cho sinh trưởng của hệ sợi cũng như năng suất và chất lượng dược liệu của 5 chủng C. militaris trong nghiên cứu, ngồi ra có sử dụng thêm các chất khác để bổ sung khống, vi lượng, vitamin cần thiết trong q trình ni cấy.
Có 4 giai đoạn chính trong sự phát triển của nấm Cordyceps militaris, bao
gồm: Giai đoạn tạo hệ sợi, giai đoạn tạo săc tố, giai đoạn tạo mầm và giai đoạn phát triển quả thể (Lu et al., 2005).
4.3.1. Đặc điểm hệ sợi của 5 chủng nấm C. militaris trong giai đoạn tạo hệ sợi Sợi nấm phát triển mạnh xâm lấn khối nguyên liệu theo chiều từ ngoài vào Sợi nấm phát triển mạnh xâm lấn khối nguyên liệu theo chiều từ ngoài vào trong, từ trên xuống dưới và lan dần xuống đáy hộp. Nhìn tổng thể, trong giai đoạn sinh sản vơ tính này hệ sợi xâm chiếm hết khối nguyên liệu trong hộp để tạo hệ sinh khối lớn chuẩn bị chuyển sang giai đoạn sinh sản hữu tính hình thành quả thể và tạo ra các bào tử hữu tính.
4.3.1.1. Thời gian sinh trưởng, phát triển hệ sợi
Sau khi nuôi giống trong môi trường dịch thể được 5 ngày (tuổi giống 120 giờ) tiến hành cấy giống vào môi trường nuôi trồng theo tỷ lệ 10ml/hộp, giống được cấy đều trên bề mặt cơ chất, sau đó đem ươm sợi trong điều kiện tối hồn tồn và theo dõi các chỉ tiêu về thời gian sinh trưởng, phát triển của hệ sợi nấm.
Bảng 4.11. Thời gian phát triển hệ sợi nấm của 5 chủng C. militaris trên môi trường nuôi trồng qua các giai đoạn
ĐVT: ngày
Chủng nấm
Thời gian sau cấy giống cho đến khi hệ sợi Bắt đầu bung sợi Phát triển 1/3 cơ chất Phát triển 1/2 cơ chất Phát triển 2/3 cơ chất Phát triển kín cơ chất ĐT1 2 7 10 13 15 ĐT2 2 6 10 12 14 ĐT3 2 6 8 10 12 ĐT4 2 5 8 10 13 ĐT5 2 8 11 15 17
Cũng giống như trong giai đoạn ươm sợi của thí nghiệm trên môi trường nhân giống cấp 1, thời kỳ này chịu ảnh hưởng của nhiều yếu tố: yếu tố chủng giống, điều kiện ươm, đảm bảo nhiệt độ thích hợp 200C – 240C, trong điều kiện
khơng có ánh sáng, đảm bảo độ xốp mơi trường thích hợp để sợi nấm có thể phát triển xâm lấm vào bên trong khối cơ chất nuôi trồng.
Kết quả cho thấy, sợi nấm của 5 chủng C. militaris bắt đầu bung sợi sau 2 ngày cấy giống, kết quả này phù hợp với kết quả thu được khi theo dõi sinh trưởng, phát triển sợi nấm trong môi trường nhân giống cấp 1 của thí nghiệm 1 của nghiên cứu này thể hiện trong Bảng 4.11.
Sau khi sợi nấm bung sợi sẽ bám vào cơ chất, lấy dinh dưỡng và tiếp tục hình thành nên các tế bào sợi nấm mới, kéo dài và phát triển theo các hướng để phủ kín dần khối cơ chất. Để hệ sợi phát triển được 1/3 cơ chất chủng ĐT3 mất 5 ngày cịn các chủng khác thì muộn hơn trong đó muộn nhất là chủng ĐT5. Các giai đoạn sau đó hệ sợi tiếp tục phát triển cho đến khi kín tồn bộ cơ chất. Phát triển kín bề mặt cơ chất rất quan trọng, chỉ tiêu này đánh giá sự sinh trưởng, phát triển của hệ sơi trên môi trường ni cấy, sự thích nghi của chủng trong điều kiện nhân giống và nuôi trồng nhân tạo, cũng như đánh giá các điều kiện nuôi trồng sao cho phù hợp với chủng đó, kết quả cho thấy 12 ngày là thời gian phát triển tồn bộ cơ chất ni trồng của chủng ĐT3, và muộn nhất là chủng ĐT5 với thời gian để hệ sợi kín tồn bộ cơ chất là 17 ngày sau khi cấy giống. Các chủng còn lại có thời gian để hệ sợi kín cơ chất là 13, 14, 15 ngày sau cấy.
4.3.1.2. Mật độ hệ sợi
Bảng 4.12. Mật độ hệ sợi 5 chủng nấm C. militaris trên môi trường nuôi trồng qua các giai đoạn
ĐVT: ngày
Chủng nấm
Thời gian sau cấy giống đến khi hệ sợi Bắt đầu bung sợi Phát triển 1/3 cơ chất Phát triển 1/2 cơ chất Phát triển 2/3 cơ chất Kín tồn bộ cơ chất ĐT1 1 2 3 3 4 ĐT2 1 2 3 4 4 ĐT3 1 2 3 4 5 ĐT4 1 2 3 4 5 ĐT5 1 2 2 3 4
Ghi chú: Độ dày hệ sợi (theo thang điểm):
+ Hệ sợi rất mỏng: 1 + Hệ sợi mỏng: 2 + Hệ sợi trung bình: 3
Kết quả Bảng 4.12 cho thấy mật độ sợi và đặc điểm hình thái sợi của 5 chủng C. militaris khi nuôi trồng trên môi trường tổng hợp không có sự khác
nhau nhiều, sợi có màu trắng đồng nhất, bề mặt sợi bơng mịn có sự liên kết chặt chẽ, và mật độ sợi cao phát triển kín bề mặt cơ chất khi ươm trong điều kiện tối và chuyển dần sang mầu vàng cam đặc trưng cho giống khi được chiếu sáng trong giai đoạn tạo sắc tố.
Tuy nhiên, thì thời gian hệ sợi phát triển kín, phủ kín bề mặt cơ chất khác nhau. Trong thời gian 1 ngày đầu sau khi cấy giống chưa có sự biểu hiện rõ, lúc này các khuẩn lạc cầu chưa bung sợi nên mặt độ sợi lúc này rất mỏng. Nhưng sang ngày thứ 2 thì thấy sợi nấm mới nẩy mầm trắng và các giai đoạn để hệ sợi phát triển 1/2 cơ chất, 2/3 cơ chất bắt đầu xuất hiện rõ các đám sợi nấm trên bề mặt nguyên liệu, sau đó liên kết lại với nhau làm cho mật độ hệ sợi tăng lên. Cùng với đó sợi nấm tiếp tục phát triển kéo dài và xâm lấn sâu vào cơ chất để bao phủ kín tồn bộ mơi trường ni trồng phía trên bề mặt và cả dưới đáy hộp, lúc này mật độ hệ sợi đạt tối đa: Rất dày với 2 chủng ĐT3, ĐT4 3 chủng còn lại ĐT1, ĐT2, ĐT5 đạt mật độ sợi dày.
4.3.1.3. Tỷ lệ nhiễm bệnh của 5 chủng nấm C. militaris trong giai đoạn tạo hệ sợi Thời gian để hệ sợi nấm phủ kín bề mặt cơ chất phụ thuộc nhiều yếu tố: Do ảnh hưởng của giống, tỷ lệ giống cấy vào môi trường cơ chất ni trồng, kích thước khuẩn lạc cầu, nồng độ giống có trong dung dịch nhân giống khi kết thúc giai đoạn nuôi giống trung gian dạng dung dịch, do kỹ thuật cấy, môi trường cấy giống… Do môi trường nuôi trồng đông trùng hạ thảo là môi trường giàu dinh dưỡng và độ ẩm cao là nguy cơ cao cho nấm bệnh và vi khuẩn xâm nhập trong quá trình cấy giống, quá trình ươm sợi, ảnh hưởng đến tỷ lệ nhiễm bệnh trong quá trình ươm sợi.
Nếu hệ sợi phủ kín cơ chất nhanh sẽ hạn chế được bị nhiễm nấm mốc hay nhiễm khuẩn, Kết quả bảng 4.14 cho thấy tỷ lệ nhiễm bệnh của chủng ĐT3 là thấp nhất với tỷ lệ nhiễm nấm bệnh là 4,4%. Chủng ĐT4 có tỷ lệ bị nhiễm bệnh