Phần 3 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
3.5. Phương pháp nghiên cứu
3.5.3. Chỉ tiêu theo dõi
3.5.3.1. Thời gian sinh trưởng qua các giai đoạn + Xác định ngày cấy giống.
+ Ngày bắt đầu bung sợi (ngày): Từ lúc bắt đầu cấy giống đến khi có ít nhất 80% đĩa thí nghiệm có hiện tượng bung sợi.
+ Ngày kín 1/3 cơ chất (ngày): Từ lúc bắt đầu cấy giống đến khi có ít nhất 90% hộp thí nghiệm có hệ sợi phát triển kín 1/3 cơ chất ni trồng.
+ Ngày kín 1/2 cơ chất (ngày): Từ lúc bắt đầu cấy giống đến khi có ít nhất 90% hộp thí nghiệm có hệ sợi phát triển kín 1/2 cơ chất ni trồng.
+ Ngày kín cơ chất (ngày): Từ lúc bắt đầu cấy giống đến khi có ít nhất 90% đĩa thí nghiệm có hệ sợi phát triển kín cơ chất.
+ Ngày hệ sợi bắt đầu chuyển màu (ngày): Từ lúc hệ sợi bắt đầu được chiếu sáng đến khi có ít nhất 90% đĩa thí nghiệm, hộp ni trồng bắt đầu có màu.
+ Ngày hệ sợi chuyển màu hoàn toàn (ngày): Từ lúc hệ sợi bắt đầu được chiếu sáng cho đến khi có ít nhất 90% đĩa thí nghiệm, hộp ni trồng chuyển màu hoàn toàn.
+ Thời gian xuất hiện 10% (ngày): Từ khi hệ sợi phát triển kín tồn bộ cơ chất đến khi xuất hiện mầm được 10% số hộp nuôi trồng trong nhà nuôi trồng.
+ Thời gian xuất hiện 90% (ngày): Từ khi hệ sợi phát triển kín tồn bộ cơ chất đến khi xuất hiện mầm được 90% số hộp nuôi trồng trong nhà nuôi trồng.
+ Thời gian sinh trưởng (ngày): Từ khi cấy giống vào môi trường cho đến khi thu hái quả thể.
3.5.3.2. Các chỉ tiêu sinh trưởng
a. Chỉ tiêu sinh trưởng hệ sợi
+ Đường kính hệ sợi ở giai đoạn nuôi khác nhau (mm): Sau 5, 10, 15, 20, 25 ngày khi cấy giống sẽ ghi nhận sự phát triển của hệ sợi bằng cách lấy trung bình đường kính trên hai trục của hệ sợi theo công thức:
d = (d1 + d2)/2
Trong đó: d1 và d2 là độ dài hai đường chéo phần hệ sợi phân bố.
+ Đường kính khuẩn lạc cầu (mm): Được thực hiện bẳng kính hiển vi điện tử có thước đo chuẩn, lấy 1ml dịch giống pha loãng 10 lần với nước cất, sau đó được soi dưới kính hiển vi điện tử để xác định đường kính khuẩn lạc cầu qua các giai đoạn.
+ Sinh khối sợi (g/l): Xác định sinh khối sợi bằng cách dịch giống mẫu được ly tâm ở 12.000 vịng trong 15 phút, lọc bằng màng milipore 0,45µm, sau khi rửa khuẩn lạc cầu (KLC) với nước cất đem sấy khô đến khối lượng không đổi, cân khối lượng hệ sợi thu được.
+ Mật độ hệ sợi nấm: Quan sát và đánh giá mật độ hệ sợi nấm theo thang điểm: - Mật độ sợi rất mỏng: 1 - Mật độ sợi mỏng: 2 - Mật độ sợi trung bình: 3 - Mật độ sợi dày: 4 - Mật độ sợi rất dày: 5
+ Mật độ khuẩn lạc cầu (KLC): Lấy mẫu dịch nấm dung dịch với thể tích 1ml pha lỗng 10 lần trên đĩa petri và đếm số lượng khuẩn lạc cầu dưới kính hiển vi điện tử. Sau đó quy theo thang điểm:
- Số lượng từ 10 – 40 KLC/1 ml dịch: (+). - Số lượng từ 41 – 80 KLC/1 ml dịch: (+ +). - Số lượng từ 81 – 120 KLC/1 ml dịch: (+ + +). - Số lượng từ 121 – 150 KLC/1 ml dịch: (+ + + +). - Số lượng trên 150 KLC/1 ml dịch: (+ + + + +).
b. Chỉ tiêu sinh trưởng quả thể nấm C. militaris
+ Chiều dài mầm (mm): Đo từ gốc mầm đến đỉnh mầm.
+ Đường kính chân mầm (mm): Dùng thước panmer điện tử đo đường kính chân mầm sát bề mặt cơ chất.
+ Đường kính đỉnh mầm (mm): Dùng thước panmer điện tử đo đường kính mầm tại vị trí cách đỉnh mầm 1mm.
+ Chiều dài quả thể (mm): Đo từ gốc sát với bề mặt cơ chất lên đến đỉnh quả thể.
+ Đường kính quả thể (mm): Dùng thước panmer điện tử đo đường kính thân quả thể tại vị trí giữa thân tính từ gốc đến đỉnh quả thể.
3.5.3.3. Chỉ tiêu hình thái
+ Màu sắc hệ sợi: Đánh giá bằng cách quan sát.
+ Màu sắc dịch giống cấp trung gian: Đánh giá bằng cách quan sát.
+ Lý tính của dịch giống cấp trung gian (độ đặc): Đánh giá bằng hình thức quan sát.
+ Màu sắc quả thể nấm: Đánh giá bằng cách quan sát. 3.5.3.4. Chỉ tiêu năng suất và chất lượng dược liệu
+ Tỷ lệ hộp có mầm quả thể (%): Tổng số hộp xuất hiện mầm quả thể trên tổng số hộp đưa vào nhà nuôi trồng tại thời điểm xuất hiện mầm 90%, lấy trung bình các lần nhắc lại.
+ Số mầm/hộp (mầm/hộp): Đếm số mầm hình thành trong một hộp nuôi trồng tại thời điểm xuất hiện mầm 90%, lấy mẫu theo đường chéo, tính trung bình các lần nhắc lại.
+ Số quả thể /hộp (quả thể/hộp): Đếm tổng số quả thể có trong một hộp ni trồng tại thời điểm thu hái. Tính trung bình cơng thức bằng trung bình của các lần nhắc lại. Lấy mẫu theo phương pháp đường chéo 5 hộp/1 lần nhắc lại.
+ Khối lượng quả thể tươi/ hộp (g/hộp): Cân tổng lượng quả thể thu hái được trong một hộp nuôi trồng tại thời điểm thu hái. Tính trung bình các lần nhắc lại trong cùng một công thức, lấy mẫu theo phương pháp đường chéo 5 hộp/1 lần nhắc lại.
thể tại thời điểm thu hái. Tính trung bình cơng thức bằng trung bình của các lần nhắc lại. Lấy mẫu theo phương pháp đường chéo 5 hộp/1 lần nhắc lại, trong 1 hộp ni trồng phần cơ chất có hình trịn theo khn hộp, được chia làm 4 phần bằng nhau, trong 5 hộp mỗi hộp sẽ lấy 1/4 đó và thu quả thể của mẫu ấy đem cân khối lượng từng quả thể và tính trung bình lần nhắc lại.
+ Hiệu suất sinh học BE (%):: Là khối lượng nấm khô thu được trên khối lượng cơ chất khô nuôi trồng ban đầu.
BE = ố ượ ả ể ô ( )
ố ượ ơ ấ ( ) x 100%
+ Hàm lượng Cordycepin, Adenosin (mg/100g): Tại thời điểm thu hái, quả thể được thu theo công thức, mỗi công thức cho vào một khay riêng, sấy cùng đợt, sau khi sấy khô lấy mỗi công thức 20g quả thể khô, cho vào túi dán kín có hút ẩm để bảo vệ mẫu, gửi đi phân tích hàm lượng dược liệu tại Viện Kiểm nghiệm Vệ sinh An toàn Thực phẩm Quốc Gia.
3.5.3.5. Chỉ tiêu về bệnh hại và hệ sợi không đạt
+ Tỷ lệ nhiễm bệnh (nhiễm khuẩn, nhiếm nấm men, nấm mốc xanh, nấm mốc đen) (%): Tổng số hộp (số đĩa, số bình) nhiễm bệnh trên tổng số hộp (đĩa, bình) của một cơng thức tại thời điểm theo dõi.
+ Tỷ lệ hệ sợi không đạt (%): Tổng số hộp (đĩa, bình) khơng đạt u cầu như hệ sợi phát triển quá chậm, hệ sợi chuyển màu không đều, mật độ sợi tại các thời điểm cuối giai đoạn quá mỏng so với tổng các hộp (đĩa, bình) của 1 cơng thức tại thời điểm theo dõi.
+ Tỷ lệ hệ sợi không chuyển màu (%): Tổng số hộp (đĩa) có hệ sợi khơng chuyển màu trên tổng số hộp có trong một cơng thức thí nghiệm tại thời điểm theo dõi (kết thúc giai đoạn chiếu sáng).