Phần 3 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
3.5. Phương pháp nghiên cứu
3.5.2. Quy trình kỹ thuật
3.5.2.1. Thí nghiệm 1: Nhân giống cấp 1 nấm C. militaris
a. Chuẩn bị môi trường
Pha môi trường nuôi cấy theo công thức SDAY: 2g Pepton + 2g Cao nấm men + 20g đường glucose + 18g agar + 0,1 g/l KH2PO4 + 0,1 g/l MgSO4. 7 H2O + 1000ml nước cất.
Hòa tan pepton, cao nấm men, agar trong nước cất theo tỷ lệ, đun sơi để hịa tan agar hớt bọt cho nước nước trong. Bổ sung đường glucose theo tỷ lệ 20 gam glucos. Điều chỉnh pH môi trường = 5,5 – 6,5.
b. Hấp khử trùng
Dịch môi trường đổ vào bình tam giác thể tích 500ml, mỗi bình chứa khoảng 300ml dung dịch. Sau đó được hấp khử trùng ở nhiệt độ 121oC trong thời gian 60 phút bằng nồi hấp điện tử.
Sau khi hấp khử trùng, dịch môi trường được đổ ra các đĩa petri đã hấp khử trùng, khoảng 6 - 10ml dịch/đĩa petri. Bật đèn UV, để nguội sau 2 – 3 ngày thì tiến hành cấy giống gốc sang mơi trường cấp I.
c. Cấy giống
Giống gốc của 5 chủng C. militaris được cấy chuyển sang các đĩa petri.
Kích thước miếng giống 0,5 x 0,5 cm. Băng kín đĩa petri bằng băng farafin và ni sợi trong điều kiện như bố trí thí nghiệm.
3.5.2.2. Thí nghiệm 2: Nhân giống cấp trung gian nấm Cordyceps militaris dạng dịch thể
a. Chuẩn bị môi trường
Cơ chất: Gạo lứt 50g/hộp + 65 ml dung dịch ding dưỡng.
Dung dịch dd: 1% pepton + 1% cao nấm men + 1g/l MgSO4.7H2O + 2g/l KH2PO4 + 1000ml nước cất.
Các chất được cân theo đúng tỷ lệ, hịa tan vào nước, sau đó bổ sung thêm nước cất cho đủ , sử dụng hóa chất NaOH 1M và HCl 1M điều chỉnh pH = 6 – 6,5.
Dung dịch vừa pha chế được đổ vào chai thủy tinh thể tích 500 ml, mỗi chai chứa 250ml dịch môi trường, khử trùng ở nhiệt độ 121oC trong thời gian 60 phút.
b. Chuẩn bị dịch giống cấp 1
Sử dụng giống cấp 1 nấm đông trùng hạ thảo đúng tuổi (25 – 28 ngày tuổi). Giống đúng tuổi là giống có tuổi giống tính từ khi cấy đến khi hệ sợi nấm phát triển kín tồn bộ mề mặt cơ chất.
Hệ sợi của ống giống cấp 1 được lấy toàn bộ vào 100 ml thể tích nước cất đã được hấp khử trùng ở 121oC trong thời gian 60 phút. Sử dụng máy xay để làm tan hệ sợi nấm tạo thành một dung dịch giống.
c. Cấy giống
Sau khi thanh trùng, chai dịch mơi trường được bảo quản trong phịng cấy sạch, khi nhiệt độ dung dịch nhỏ hơn 30oC thì tiến hành cấy giống. Thao tác cấy giống được cấy trong tủ cấy an toàn sinh học, đảm bảo điều kiện vô trùng, hạn chế và giảm tỉ lệ nhiễm. Cấy dịch giống cấp I/1 chai môi trường dịch thể theo tỷ lệ 8%.
d. Nuôi sợi
Các chai dịch sau khi cấy giống được nuôi trên máy lắc 120 vịng/phút. Trong điều kiện tối hồn tồn, nhiệt độ 20 - 22oC.
3.5.2.3. Ni trồng nấm Cordyceps militaris
a. Chuẩn bị môi trường
Mỗi hộp nhựa kích thước cao 10 cm, dung tích 750 ml, cho vào hộp 50g gạo lứt, dung dịch dinh dưỡng 65ml, với công thức môi trường tùy thuộc vào từng cơng thức, miệng hộp được đậy kín bằng túi nilon PE và chun buộc.
b. Hấp khử trùng
Môi trường được hấp khử trùng ở 121oC trong thời gian 60 phút.
c. Cấy giống
Môi trường khử trùng được để nguội rồi tiến hành cấy giống.
Loại giống: Giống C. militaris cấp trung gian dạng dịch thể 5 ngày tuổi. Tỷ lệ giống cấy từ 10 ml giống/hộp môi trường.
d. Nuôi sợi
Giống nấm sau khi cấy được ươm sợi trong điều kiện nhiệt độ 20 - 22oC, độ ẩm khơng khí 60 - 70%.
e. Nuôi quả thể và thu hái
Sau cấy giống, khi hệ sợi phát triển kín tồn bộ cơ chất cũng là lúc hệ sợi nấm bắt đầu chuyển sang giai đoạn sinh trưởng sinh thực. Lúc này bắt đầu điều chỉnh các điều kiện chăm sóc phù hợp với các thí nghiệm đã được bố trí: Ni ở nhiệt độ 18 – 220C, độ ẩm 85% - 90%.
Khi quả thể nấm C. militaris phát triển đến khi phần đỉnh sinh trưởng quả
thể nấm xuất hiện chấm màu trắng là thời điểm thu hái thích hợp. Quả thể nấm Đông trùng hạ thảo sau khi thu hái sấy ở nhiệt độ 30oC và tăng dần lên 400C có quạt gió.