Phần 3 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
3.2.Thời gian nghiên cứu
Từ tháng 10 năm 2016 đến tháng 8 năm 2017. 3.3. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU
3.3.1. Đối tượng nghiên cứu
Đối tượng nghiên cứu là 5 chủng nấm đông trùng hạ thảo (Cordyceps militari). Giống gốc của 5 chủng giống nấm C. militaris được ký hiệu ĐT1, ĐT2,
ĐT3, ĐT4, ĐT5. Nhập nội từ Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển nấm ăn châu Á Thái Bình Dương - Phúc Kiến - Trung quốc.
Trong nghiên cứu khơng sử dụng giống đối chứng vì ở Việt Nam hiện nay chưa có chủng Cordyceps militaris nào được cơng nhận là giống chính thức. 3.3.2. Vật tư tiêu hao, hóa chất, ngun liệu dùng trong thí nghiệm 3.3.2.1. Vật tư, hóa chất tiêu hao
- Đĩa petri, ống nghiệm, bình tam giác, bơng nút, hộp nhựa, bình thủy tinh, màng film , giấy lọc, màng lọc, ống fancol, pipet,.…..
- Đường glucose, cao nấm men, pepton, MgSO4.7H2O, KH2PO4 , HCl, NaOH, NaNO3, NH4NO3….
- Nhộng tằm, gạo lứt.
3.3.2.2. Dụng cụ và thiết bị thí nghiệm
- Nồi luộc mơi trường, bộ cốc đong, rót mơi trường, phễu thủy tinh, găng tay, que cấy, dao cấy, cân phân tích, màng lọc, giấy lọc…
- Tủ cấy an tồn sinh học, máy li tâm, tủ bảo ôn, máy khuấy từ, máy lắc, máy xay, bình lên men Duran dung tích 2l, kính hiển vi soi sợi và chụp ảnh, máy đo pH, máy đo độ ẩm - nhiệt độ phòng, máy đo cường độ CO2 và máy đo cường độ chiếu sáng, nồi hấp khử trùng, phịng ni giống, ni sợi có điều hịa nhiệt
độ 2 chiều và quạt thơng gió, bóng đèn huỳnh quang…..
- Nhà ni trồng có lắp máy lạnh, có khả năng điều chỉnh nhiệt độ từ 5 - 25oC; hệ thống thơng gió và tưới phun sương tự động; hệ thống đèn LED chiếu sáng, có khả năng điều chỉnh thời gian và cường độ chiếu sáng.
3.4. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
1. Đánh giá sự sinh trưởng, phát triển hệ sợi của 5 chủng nấm Cordyceps militaris trong giai đoạn nhân giống cấp 1.
2. Đánh giá sinh trưởng, phát triển hệ sợi, sinh khối sợi của 5 chủng nấm
Cordyceps militaris trong giai đoạn nhân giống cấp trung gian trong môi trường
dịch thể.
3. Đánh giá sinh trưởng, phát triển hệ sợi, sự hình thành quả thể, tạo năng suất, chất lượng được liệu của 5 chủng nấm Cordyceps militaris trên môi trường nuôi trồng nhân tạo.
3.5. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.5.1. Bố trí thí nghiệm 3.5.1. Bố trí thí nghiệm
Nghiên cứu gồm 3 thí nghiệm được thực hiện tuần tự từ thí nghiệm 1 đến thí nghiệm 3.
3.5.1.1. Thí nghiệm 1. Nghiên cứu sự sinh trưởng, phát triển hệ sợi của 5 chủng nấm Cordyceps militaris trong môi trường nhân giống cấp 1
Giống nấm C.militaris nhân nuôi trên môi trường nhân giống cấp 1 theo
phương pháp của Sung et al. (2010).
Công thức 1: Giống cấp I của chủng ĐT1 Công thức 2: Giống cấp I của chủng ĐT2 Công thức 3: Giống cấp I của chủng ĐT3 Công thức 4: Giống cấp I của chủng ĐT4 Công thức 5: Giống cấp I của chủng ĐT5
Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên (CRD) với 3 lần nhắc lại.Mỗi công thức nghiên cứu gồm gồm 10 đĩa petri/1 lần nhắc lại. Tổng số 30 đĩa petri/1 công thức thí nghiệm. Theo dõi các chỉ tiêu sinh trưởng phát triển trên 5 đĩa petri/1 nhắc lại/1 cơng thức thí nghiệm.
3.5.1.2. Thí nghiệm 2. Nghiên cứu sinh trưởng, phát triển hệ sợi nấm Cordyceps militaris trong giai đoạn nhân giống cấp trung gian dạng dịch thể
Giống cấp 1 của 5 chủng nấm C. militaris được nhân nuôi trên môi trường dịch lỏng theo phương pháp của Zhang et al., (2016).
Công thức 1: Giống cấp trung gian chủng ĐT1. Công thức 2: Giống cấp trung gian chủng ĐT2. Công thức 3: Giống cấp trung gian chủng ĐT3. Công thức 4: Giống cấp trung gian chủng ĐT4. Công thức 5: Giống cấp trung gian chủng ĐT5.
Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hồn tồn ngẫu nhiên (CRD) với 3 lần nhắc lại. Mỗi cơng thức nghiên cứu gồm 5 bình tam giác/1 lần nhắc lại. Tổng số 15 bình/1 cơng thức thí nghiệm.
3.5.1.3. Thí nghiệm 3: Nghiên cứu sinh trưởng, phát triển hệ sợi, sự hình thành quả thể, năng suất, chất lượng của 5 chủng nấm Cordyceps militaris trên môi trường nuôi trồng
Nấm C. militaris được nuôi trồng trong mơi trường với cơ chất gạo lứt, có bổ sung thêm dung dịch dinh dưỡng theo phương pháp của Shrestha et al.,(2012).
Công thức 1: ĐT1 Công thức 2: ĐT2 Công thức 3: ĐT3 Công thức 4: ĐT4 Cơng thức 5: ĐT5
Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hồn tồn ngẫu nhiên (CRD) với 3 lần nhắc lại. Mỗi công thức nghiên cứu gồm 30 hộp/1 lần nhắc lại. Tổng số 90 hộp/1 cơng thức thí nghiệm.
3.5.1.4. Chất lượng dược liệu của nấm C. militaris
Hàm lượng Cordycepin, Adenosin: Chính là hàm lượng hoạt chất dược liệu có trong 1g quả thể khô. Sau khi thu hái và được sấy khô rồi đem phân tích bằng phương pháp săc ký HPLC (High Performance Liquid Chromatography). Đơn vị tính: mg/g hoặc mg/100g (tùy theo quy định của đơn vị nhận mẫu phân tích).
3.5.2. Quy trình kỹ thuật
3.5.2.1. Thí nghiệm 1: Nhân giống cấp 1 nấm C. militaris
a. Chuẩn bị môi trường
Pha môi trường nuôi cấy theo công thức SDAY: 2g Pepton + 2g Cao nấm men + 20g đường glucose + 18g agar + 0,1 g/l KH2PO4 + 0,1 g/l MgSO4. 7 H2O + 1000ml nước cất.
Hòa tan pepton, cao nấm men, agar trong nước cất theo tỷ lệ, đun sơi để hịa tan agar hớt bọt cho nước nước trong. Bổ sung đường glucose theo tỷ lệ 20 gam glucos. Điều chỉnh pH môi trường = 5,5 – 6,5.
b. Hấp khử trùng
Dịch môi trường đổ vào bình tam giác thể tích 500ml, mỗi bình chứa khoảng 300ml dung dịch. Sau đó được hấp khử trùng ở nhiệt độ 121oC trong thời gian 60 phút bằng nồi hấp điện tử.
Sau khi hấp khử trùng, dịch môi trường được đổ ra các đĩa petri đã hấp khử trùng, khoảng 6 - 10ml dịch/đĩa petri. Bật đèn UV, để nguội sau 2 – 3 ngày thì tiến hành cấy giống gốc sang môi trường cấp I.
c. Cấy giống
Giống gốc của 5 chủng C. militaris được cấy chuyển sang các đĩa petri.
Kích thước miếng giống 0,5 x 0,5 cm. Băng kín đĩa petri bằng băng farafin và ni sợi trong điều kiện như bố trí thí nghiệm.
3.5.2.2. Thí nghiệm 2: Nhân giống cấp trung gian nấm Cordyceps militaris dạng dịch thể
a. Chuẩn bị môi trường
Cơ chất: Gạo lứt 50g/hộp + 65 ml dung dịch ding dưỡng.
Dung dịch dd: 1% pepton + 1% cao nấm men + 1g/l MgSO4.7H2O + 2g/l KH2PO4 + 1000ml nước cất.
Các chất được cân theo đúng tỷ lệ, hòa tan vào nước, sau đó bổ sung thêm nước cất cho đủ , sử dụng hóa chất NaOH 1M và HCl 1M điều chỉnh pH = 6 – 6,5.
Dung dịch vừa pha chế được đổ vào chai thủy tinh thể tích 500 ml, mỗi chai chứa 250ml dịch mơi trường, khử trùng ở nhiệt độ 121oC trong thời gian 60 phút.
b. Chuẩn bị dịch giống cấp 1
Sử dụng giống cấp 1 nấm đông trùng hạ thảo đúng tuổi (25 – 28 ngày tuổi). Giống đúng tuổi là giống có tuổi giống tính từ khi cấy đến khi hệ sợi nấm phát triển kín tồn bộ mề mặt cơ chất.
Hệ sợi của ống giống cấp 1 được lấy tồn bộ vào 100 ml thể tích nước cất đã được hấp khử trùng ở 121oC trong thời gian 60 phút. Sử dụng máy xay để làm tan hệ sợi nấm tạo thành một dung dịch giống.
c. Cấy giống
Sau khi thanh trùng, chai dịch mơi trường được bảo quản trong phịng cấy sạch, khi nhiệt độ dung dịch nhỏ hơn 30oC thì tiến hành cấy giống. Thao tác cấy giống được cấy trong tủ cấy an tồn sinh học, đảm bảo điều kiện vơ trùng, hạn chế và giảm tỉ lệ nhiễm. Cấy dịch giống cấp I/1 chai môi trường dịch thể theo tỷ lệ 8%.
d. Nuôi sợi
Các chai dịch sau khi cấy giống được nuôi trên máy lắc 120 vịng/phút. Trong điều kiện tối hồn tồn, nhiệt độ 20 - 22oC.
3.5.2.3. Nuôi trồng nấm Cordyceps militaris
a. Chuẩn bị mơi trường
Mỗi hộp nhựa kích thước cao 10 cm, dung tích 750 ml, cho vào hộp 50g gạo lứt, dung dịch dinh dưỡng 65ml, với công thức môi trường tùy thuộc vào từng công thức, miệng hộp được đậy kín bằng túi nilon PE và chun buộc.
b. Hấp khử trùng
Môi trường được hấp khử trùng ở 121oC trong thời gian 60 phút.
c. Cấy giống
Môi trường khử trùng được để nguội rồi tiến hành cấy giống.
Loại giống: Giống C. militaris cấp trung gian dạng dịch thể 5 ngày tuổi. Tỷ lệ giống cấy từ 10 ml giống/hộp môi trường.
d. Nuôi sợi
Giống nấm sau khi cấy được ươm sợi trong điều kiện nhiệt độ 20 - 22oC, độ ẩm khơng khí 60 - 70%.
e. Ni quả thể và thu hái
Sau cấy giống, khi hệ sợi phát triển kín tồn bộ cơ chất cũng là lúc hệ sợi nấm bắt đầu chuyển sang giai đoạn sinh trưởng sinh thực. Lúc này bắt đầu điều chỉnh các điều kiện chăm sóc phù hợp với các thí nghiệm đã được bố trí: Ni ở nhiệt độ 18 – 220C, độ ẩm 85% - 90%.
Khi quả thể nấm C. militaris phát triển đến khi phần đỉnh sinh trưởng quả
thể nấm xuất hiện chấm màu trắng là thời điểm thu hái thích hợp. Quả thể nấm Đơng trùng hạ thảo sau khi thu hái sấy ở nhiệt độ 30oC và tăng dần lên 400C có quạt gió.
3.5.3. Chỉ tiêu theo dõi
3.5.3.1. Thời gian sinh trưởng qua các giai đoạn + Xác định ngày cấy giống.
+ Ngày bắt đầu bung sợi (ngày): Từ lúc bắt đầu cấy giống đến khi có ít nhất 80% đĩa thí nghiệm có hiện tượng bung sợi.
+ Ngày kín 1/3 cơ chất (ngày): Từ lúc bắt đầu cấy giống đến khi có ít nhất 90% hộp thí nghiệm có hệ sợi phát triển kín 1/3 cơ chất ni trồng.
+ Ngày kín 1/2 cơ chất (ngày): Từ lúc bắt đầu cấy giống đến khi có ít nhất 90% hộp thí nghiệm có hệ sợi phát triển kín 1/2 cơ chất ni trồng.
+ Ngày kín cơ chất (ngày): Từ lúc bắt đầu cấy giống đến khi có ít nhất 90% đĩa thí nghiệm có hệ sợi phát triển kín cơ chất.
+ Ngày hệ sợi bắt đầu chuyển màu (ngày): Từ lúc hệ sợi bắt đầu được chiếu sáng đến khi có ít nhất 90% đĩa thí nghiệm, hộp ni trồng bắt đầu có màu.
+ Ngày hệ sợi chuyển màu hoàn toàn (ngày): Từ lúc hệ sợi bắt đầu được chiếu sáng cho đến khi có ít nhất 90% đĩa thí nghiệm, hộp ni trồng chuyển màu hoàn toàn.
+ Thời gian xuất hiện 10% (ngày): Từ khi hệ sợi phát triển kín tồn bộ cơ chất đến khi xuất hiện mầm được 10% số hộp nuôi trồng trong nhà nuôi trồng.
+ Thời gian xuất hiện 90% (ngày): Từ khi hệ sợi phát triển kín tồn bộ cơ chất đến khi xuất hiện mầm được 90% số hộp nuôi trồng trong nhà nuôi trồng.
+ Thời gian sinh trưởng (ngày): Từ khi cấy giống vào môi trường cho đến khi thu hái quả thể.
3.5.3.2. Các chỉ tiêu sinh trưởng
a. Chỉ tiêu sinh trưởng hệ sợi
+ Đường kính hệ sợi ở giai đoạn nuôi khác nhau (mm): Sau 5, 10, 15, 20, 25 ngày khi cấy giống sẽ ghi nhận sự phát triển của hệ sợi bằng cách lấy trung bình đường kính trên hai trục của hệ sợi theo cơng thức:
d = (d1 + d2)/2
Trong đó: d1 và d2 là độ dài hai đường chéo phần hệ sợi phân bố.
+ Đường kính khuẩn lạc cầu (mm): Được thực hiện bẳng kính hiển vi điện tử có thước đo chuẩn, lấy 1ml dịch giống pha loãng 10 lần với nước cất, sau đó được soi dưới kính hiển vi điện tử để xác định đường kính khuẩn lạc cầu qua các giai đoạn.
+ Sinh khối sợi (g/l): Xác định sinh khối sợi bằng cách dịch giống mẫu được ly tâm ở 12.000 vịng trong 15 phút, lọc bằng màng milipore 0,45µm, sau khi rửa khuẩn lạc cầu (KLC) với nước cất đem sấy khô đến khối lượng không đổi, cân khối lượng hệ sợi thu được.
+ Mật độ hệ sợi nấm: Quan sát và đánh giá mật độ hệ sợi nấm theo thang điểm: - Mật độ sợi rất mỏng: 1 - Mật độ sợi mỏng: 2 - Mật độ sợi trung bình: 3 - Mật độ sợi dày: 4 - Mật độ sợi rất dày: 5
+ Mật độ khuẩn lạc cầu (KLC): Lấy mẫu dịch nấm dung dịch với thể tích 1ml pha loãng 10 lần trên đĩa petri và đếm số lượng khuẩn lạc cầu dưới kính hiển vi điện tử. Sau đó quy theo thang điểm:
- Số lượng từ 10 – 40 KLC/1 ml dịch: (+). - Số lượng từ 41 – 80 KLC/1 ml dịch: (+ +). - Số lượng từ 81 – 120 KLC/1 ml dịch: (+ + +). - Số lượng từ 121 – 150 KLC/1 ml dịch: (+ + + +). - Số lượng trên 150 KLC/1 ml dịch: (+ + + + +).
b. Chỉ tiêu sinh trưởng quả thể nấm C. militaris
+ Chiều dài mầm (mm): Đo từ gốc mầm đến đỉnh mầm.
+ Đường kính chân mầm (mm): Dùng thước panmer điện tử đo đường kính chân mầm sát bề mặt cơ chất.
+ Đường kính đỉnh mầm (mm): Dùng thước panmer điện tử đo đường kính mầm tại vị trí cách đỉnh mầm 1mm.
+ Chiều dài quả thể (mm): Đo từ gốc sát với bề mặt cơ chất lên đến đỉnh quả thể.
+ Đường kính quả thể (mm): Dùng thước panmer điện tử đo đường kính thân quả thể tại vị trí giữa thân tính từ gốc đến đỉnh quả thể.
3.5.3.3. Chỉ tiêu hình thái
+ Màu sắc hệ sợi: Đánh giá bằng cách quan sát.
+ Màu sắc dịch giống cấp trung gian: Đánh giá bằng cách quan sát.
+ Lý tính của dịch giống cấp trung gian (độ đặc): Đánh giá bằng hình thức quan sát.
+ Màu sắc quả thể nấm: Đánh giá bằng cách quan sát. 3.5.3.4. Chỉ tiêu năng suất và chất lượng dược liệu
+ Tỷ lệ hộp có mầm quả thể (%): Tổng số hộp xuất hiện mầm quả thể trên tổng số hộp đưa vào nhà nuôi trồng tại thời điểm xuất hiện mầm 90%, lấy trung bình các lần nhắc lại.
+ Số mầm/hộp (mầm/hộp): Đếm số mầm hình thành trong một hộp nuôi trồng tại thời điểm xuất hiện mầm 90%, lấy mẫu theo đường chéo, tính trung bình các lần nhắc lại.
+ Số quả thể /hộp (quả thể/hộp): Đếm tổng số quả thể có trong một hộp nuôi trồng tại thời điểm thu hái. Tính trung bình cơng thức bằng trung bình của các lần nhắc lại. Lấy mẫu theo phương pháp đường chéo 5 hộp/1 lần nhắc lại.
+ Khối lượng quả thể tươi/ hộp (g/hộp): Cân tổng lượng quả thể thu hái được trong một hộp nuôi trồng tại thời điểm thu hái. Tính trung bình các lần nhắc lại trong cùng một công thức, lấy mẫu theo phương pháp đường chéo 5 hộp/1 lần nhắc lại.
thể tại thời điểm thu hái. Tính trung bình cơng thức bằng trung bình của các lần nhắc lại. Lấy mẫu theo phương pháp đường chéo 5 hộp/1 lần nhắc lại, trong 1 hộp nuôi trồng phần cơ chất có hình trịn theo khn hộp, được chia làm 4 phần bằng nhau, trong 5 hộp mỗi hộp sẽ lấy 1/4 đó và thu quả thể của mẫu ấy đem cân khối lượng từng quả thể và tính trung bình lần nhắc lại.
+ Hiệu suất sinh học BE (%):: Là khối lượng nấm khô thu được trên khối lượng cơ chất khô nuôi trồng ban đầu.
BE = ố ượ ả ể ô ( )
ố ượ ơ ấ ( ) x 100%
+ Hàm lượng Cordycepin, Adenosin (mg/100g): Tại thời điểm thu hái, quả thể được thu theo công thức, mỗi công thức cho vào một khay riêng, sấy cùng đợt, sau khi sấy khô lấy mỗi công thức 20g quả thể khơ, cho vào túi dán kín có hút ẩm để bảo vệ mẫu, gửi đi phân tích hàm lượng dược liệu tại Viện Kiểm nghiệm Vệ sinh An toàn Thực phẩm Quốc Gia.
3.5.3.5. Chỉ tiêu về bệnh hại và hệ sợi không đạt
+ Tỷ lệ nhiễm bệnh (nhiễm khuẩn, nhiếm nấm men, nấm mốc xanh, nấm mốc đen) (%): Tổng số hộp (số đĩa, số bình) nhiễm bệnh trên tổng số hộp (đĩa, bình) của một cơng thức tại thời điểm theo dõi.
+ Tỷ lệ hệ sợi khơng đạt (%): Tổng số hộp (đĩa, bình) khơng đạt u cầu như hệ sợi phát triển quá chậm, hệ sợi chuyển màu không đều, mật độ sợi tại các