2.5.1.1. Nghiên cứu về tế bào học và di truyền của Cordyceps militaris
Nghiên cứu về nấm C. militaris đã được tiến hành về nguồn gen, dinh dưỡng, môi trường, yêu cầu về điều kiện nuôi trồng, cách thức kết hợp sợi nấm, sinh hóa và đặc tính dược lý. Nấm C. militaris đã được nhiều đánh giá, nhưng ít người tập trung vào sinh học của nó. Cho đến nay mới chỉ có một số ít nghiên cứu về tế bào học của C. militaris, các nghiên cứu trước đây chỉ ra rằng C.
militaris chỉ có hai nhiễm sắc thể, trong khi đó nghiên cứu gần đây nhận định
rằng có 7 nhiễm sắc thể (Wang et al., 2010). Bộ gen của C. militaris có kích thước chính xác là 32,2 Mb (Zheng et al., 2011), nhỏ hơn so với hai loại nấm gây bệnh côn trùng khác, Metarhizium anisopliae (39,04 Mb) và M. acridum (38,05 Mb) (Gao et al., 2011).
Nghiên cứu về di truyền nấm đòi hỏi phải có hệ thống chuyển đổi hiệu quả. Zheng et al (2011), đã phát triển và tối ưu hóa sự chuyển đổi qua trung gian
Agrobacterium tumefaciens cho C. militaris, có thể giúp xác định gen chức năng.
Phân tích EST cho kết quả là các mô hình phiên mã khác nhau của C. militaris trong lên men lỏng hoặc lên men rắn, và trong quả thể được sản xuất trên giá thể tổng hợp chất nền là gạo lứt hoặc quả thể trên ký chủ nhộng (Xiong et al., 2010).
Phân tích trên cho thấy các gen liên quan đến quá trình chuyển hóa tế bào, chuyển hóa năng lượng, đáp ứng Stress được tăng lên trong quá trình phát triển
vô tính, và các gen gắn với cấu trúc tế bào được tăng cường trong quá trình phát triển sinh sản hữu tính (Xiong et al., 2010). Tuy có nhiều nghiên cứu đã mô tả các điều kiện ảnh hưởng đến sự tạo thành quả thể và sự hình thành các chất chuyển hóa (Cordycepin, adenosin, polysaccharide) nhưng hiện nay thì cơ sở di truyền của các quá trình này vẫn còn chưa được rõ.
Mặc dù vậy, đến nay bộ gen của C. militaris cũng đã được giải trình tự. tổng cộng có 9.684 gen mã hóa được dự đoán và có 13,7% trong số này là gen cụ thể cao hơn so với tỷ lệ của M. anisopliae (4,8%) hoặc M. acridum (3,5%). Khoảng 16% gen C. militaris (1.547) liên quan sự tương tác của mầm bệnh. Không có sự tiến hóa các độc tố nấm đã biết ảnh hưởng đến con người (Zheng et al., 2011), phù hợp với mức độ an toàn khi sử dụng nấm C. militaris như một dược phẩm.
Hơn 63% trong tổng số 9.684 gen là thể hiện trong suốt quá trình phát triển của sợi nấm và sự hình thành quả thể. Các nhân tố phiên mã kiểu Zn2Cys6 và MAPK xảy ra trong suốt quá trình hình thành quả thể, không phải theo con đường PKA, khác với tạo quả thể của các loại nấm khác. Trình tự hoàn chỉnh của bộ gen C. militaris sẽ tạo điều kiện cho những nghiên cứu chức năng của gen và làm sáng tỏ nền di truyền cho sinh tổng hợp các thành phần hoạt tính sinh học, khả năng gây bệnh của côn trùng và ngăn chặn sự thoái hóa (Zheng et al., 2011).
Một số protein của nấm C. militaris đã được tinh chế, và một số gen của C. militaris đã được nhân bản. Các protein tinh khiết bao gồm một số protease trypsin ngoại bào P-1-1, một protease độc tế bào và kháng nấm CMP, một peptide kháng nấm (Park et al., 2009).
Hệ thống kết hợp của C. militaris đã được nghiên cứu trong nhiều trường hợp ở các cấp độ nuôi trồng và phân tử khác nhau. Khi nuôi cấy hai dòng đơn bào tử với nhau hoặc trên các mặt đối diện của môi trường nuôi cấy, và các nghiên cứu cho thấy không thể sản xuất thể đệm (quả thể) khi các chủng đơn bào tử phát triển một mình trên một môi trường nhân nuôi. Sau đó Shrestha et al.
(2004), các chủng đơn bào tử C. militaris sản xuất quả thể khi nuôi cấy kết hợp. Khi được phân lập đơn bào tử và đưa vào nuôi trồng trong sản xuất bị biến dạng quả thể, nhưng khi nuôi hai mặt đối diện của hai đơn bào tử đối diện của đĩa petri có môi trường agar có sự giao thoa gộp sợi giữa hai dòng đơn bào tử. Những kết quả này cho thấy nấm C. militaris là một lưỡng cực của nấm ký sinh.
Đã tìm thấy được kiểu kết hợp để được ổn định cho đến 10 thế hệ của giống gốc ban đầu (Sung et al., 2006).
Khi phát triển một mình, hầu hết các chủng của dòng đơn bào tử không thể phát triển tốt hoặc chỉ sản sinh ra các tế bào hoặc quả thể bất thường (Wen et al., 2009). Một số nghiên cứu phân tử khác còn chứng minh rằng C. militaris có kiểu đối lập ngược khẳng định tính lưỡng cực dị tính trong C. militaris.
Dựa trên các nghiên cứu về cấp độ tế bào học mà có nhiều phương pháp được áp dụng để tạo ra các chủng C. militaris đáp ứng nhu cầu trong sản xuất: Áp dụng sự hình thành và tạo các tế bào trần (Protoplast) để tạo ra thể lai F1 đã được nghiên cứu rộng rãi (Li et al., 2011) và gây đột biến với những đặc điểm vượt trội, như đạt hàm lượng Cordycepin cao, Polysaccharide, số lượng quả thể, kích thước quả thể thay đổi theo mong muốn đáp ứng sản xuất bằng phương pháp chiếu xạ. 2.5.1.2. Nghiên cứu về nhân sinh khối Cordyceps militaris dạng dịch thể
Hiện nay các nghiên cứu, sản xuất nấm đông trùng hạ thảo cũng chủ yếu là thu sinh khối sợi bằng phương pháp lên men, nhất là Cordycepssinensis do chưa nuôi trồng được trên môi trường nhân tạo nên sử dụng phương pháp lên men là chính. Ngoài ra ứng dụng của phương pháp lên men để thu sinh khối sợi nấm được áp dụng vào trong sản xuất giống nấm dạng dịch thể. Đã có rất nhiều nhà máy sản xuất nấm công nghiệp của Trung Quốc, Hàn Quốc, Nhật Bản đã sử dụng công nghệ nhân giống dịch thể để sản xuất nấm trên quy mô công nghiệp nhằm giảm chi phí nhà xưởng, nâng cao chất lượng và độ đồng đều của giống nấm.
Có rất nhiều công trình nghiên cứu về công nghệ nuôi Cordyceps militaris
dạng dịch thể với mục đích tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy, đặc biệt là tối ưu hóa môi trường nuôi dưỡng. Cacbon và nitơ được xác định là 2 nguồn dinh dưỡng chủ yếu trong nhân giống dịch thể Cordyceps militaris.
Để xác định nguồn dinh dưỡng carbon thích hợp cho sinh trưởng của nấm
Cordyceps militaris, Park et al. (2001), đã thí nghiệm nuôi cấy Cordyceps
militaris trên 08 loại đường khác nhau (sucrose, glucose, fructose, maltose,
glactose, xylose, starch, inulin). Kết quả nghiên cứu cho thấy quá trình sinh tổng hợp các hợp chất polysacharide ngoại bào của nấm đông trùng hạ thảo Cordyceps
militaris diễn ra mạnh nhất trên môi trường có bổ sung đường sucrose (0,95 g/l),
glucose là 0,8 g/l, thấp nhất ở Inulin 0,17 g/l.
năng sinh tổng hợp các hợp chất ngoại bào của nấm Cordyceps militaris trên nguồn carbon vô cơ (sucrose) và nguồn carbon hữu cơ (cám ngô) với nhau. Sinh khối sợi và hàm lượng các hợp chất ngoại bào đạt cao nhất khi nồng độ đường sucrose trong dung dịch đạt 40g/l, trong khi chỉ cần sử dụng 10 g/l cám ngô sinh khối sợi nấm và quá trình sinh tổng hợp các chất đạt chỉ số lớn nhất và cao hơn so với nguồn sucrose.
Tiếp theo đó, Mao and Zhong. (2004), đã tiến hành nuôi cấy Cordyceps
militaris trong môi trường dịch thể có bổ sung các nguồn đường khác nhau
(lactose, sucrose, glucose, fructose, galactose, maltose và xylose). Các chỉ tiêu như mật độ tế bào, sự hấp thụ đường và khả năng tổng hợp cordycepin đã được tác giả và nhóm nghiên cứu theo dõi. Số liệu ghi chép cho biết mật độ tế bào đạt cực đại, trọng lượng tế bào và tốc độ tăng trưởng đạt giá trị cực đại trong công thức có bổ sung galactose sau 9 ngày nuôi cấy (trọng lượng tế bào khô (DW): 19,27 g/l). Trong môi trường có lactose sinh khối sợi nấm thấp (8,0 g/l) và khi kết thúc quá trình sinh trưởng trong môi trường nhân giống vẫn còn dư đường. Về khả năng tổng hợp cordycepin, glucose cho hiệu quả tổng hợp cao nhất 262,7 g/ml. Từ những kết quả đó tác giả đã chọn glucose là nguồn cung cấp cacbon chính cho nhân giống Cordyceps militaris dịch thể.
Trên cơ sở kết quả trên, Mao et al. (2005), tiếp tục nghiên cứu thêm về ảnh hưởng của nồng độ glucose ban đầu tới sinh trưởng phát triển hệ sợi nấm. Thí nghiệm được tiến hành theo 03 công thức với 03 nồng độ glucose khác nhau (30 g/l, 40 g/l và 50 g/l). Kết quả thu được cho thấy rằng sự phát triển của tế bào tăng khi nồng độ glucose tăng, tuy nhiên thì hàm lượng cordycepin lại giảm khi nồng độ đường vượt quá 40 g/l.
Tương tự như cacbon, để xác định nguồn dinh dưỡng nitơ thích hợp cho nhân giống dịch thể Cordyceps militaris các nhà nghiên cứu cũng tiến hành các thí nghiệm nuôi cấy Cordyceps militaris trên các môi trường có bổ sung nitơ khác nhau.
Shih et al. (2007), nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn nitơ tới sự phát triển hệ sợi và sinh tổng hợp các chất chuyển hóa của chủng giống Cordyceps militaris
CCRC 32219. Nitơ hữu cơ được xác định là nguồn dinh dưỡng phù hợp hơn so với nitơ vô cơ và cao nấm men là dinh dưỡng tối ưu nhất với hàm lượng sinh khối sợi lớn nhất (1,5 g/l), sau đó là peptone. Kết quả này tương đối phù hợp với kết quả nghiên cứu của Park et al. (2001), và ông cũng chỉ ra rằng cao nấm men
sẽ cho hàm lượng cordycepin cao nhất khi nuôi cấy Cordyceps militaris trong môi trường nhân giống dịch thể.
Ngoài việc cung cấp đủ hàm lượng carbon hay nitơ thì việc xác định tỷ lệ C/N trong nhân giống dịch thể nấm Cordyceps militaris là yếu tố khá quan trọng. Tỷ lệ C/N tối ưu cho phát triển hệ sợi và tổng hợp exopolysacharide của
Cordyceps militaris là 2/1 khi sử dụng glucose làm nguồn cung cấp carbon
(Masuda, 2006) hoặc 42g glucose/l với 15,8 g peptone/l (Mao et al., 2005). Bên cạnh đó những nguyên tố khoáng cũng đóng vai trò thiết yếu trong quá trình sinh trưởng của sợi nấm dịch thể. Ion kim loại đóng vai trò là coenzyme thiết yếu cho phản ứng xúc tác của enzyme, đặc biệt là enzyme sử dụng ATP và tổng hợp DNA và RNA. Nhóm hỗn hợp chứa KH2PO4 0,5 g/L và MgSO4∙7H2O 0,5g/l, được xác định là hỗn hợp tối ưu cho sợi nấm sinh trưởng (Park et al., 2001).
Hung et al. (2009), cho biết sự phát triển của sợi nấm Cordyceps militaris
cao nhất ở 20oC và thấp nhất ở 30oC. Ở nhiệt độ cao (lớn hơn 30oC sợi nấm chìm trong dịch dinh dưỡng không có khả năng phát triển lên bề mặt). Đồng thời các chủng Cordyceps militaris có khả năng tổng hợp chất Cordycepin cao nhất ở nhiệt độ 25oC. Giá trị pH tối ưu là từ 6 đến 8 (Shrestha et al., 2012).
Số vòng lắc cũng là một thông số quan trọng, ảnh hưởng đến cơ chất, nhiệt độ và hàm lượng oxi không hòa tan (OD), nó có thể làm thay đổi hình thái sợi nấm. Sinh khối sợi nấm đông trùng hạ thảo sẽ thu được nhiều nhất (40,6g/l) ở chế độ lắc 200 vòng/phút và tỷ lệ sục khí 1,5vvm (Hung et al., 2009).
Theo thời gian nuôi cấy càng tăng thì khuẩn lạc cầu sẽ tăng về kích thước (Han et al., 2009). Sản phẩm của nuôi cấy dịch thể bao gồm pillets (khuẩn lạc cầu), bào tử đính (conidial), sợi nấm (hyphal). Trong đó, pillet được xem là không phù hợp cho cấy giống với 03 lí do:
- Lí do đầu tiên và quan trọng là pellets không sinh trưởng nhanh như bào tử đính (conidial) hoặc dung dịch huyền phù sợi (hyphal suspensions) trên cơ chất nuôi trồng.
- Thứ hai, pellets thường không cảm ứng hình thành được mầm quả thể. - Thứ ba, pellets khó để định lượng.
Ngoài ra, Park et al. (2001), đã nghiên cứu ảnh hưởng của tuổi giống và tỷ lệ giống cấy đến sinh khối sợi và khả năng đồng hóa các chất của nấm
dường như không hoặc ít có ảnh hưởng rõ ràng tới quá trình sinh tổng hợp các polysacharide ngoại bào và sinh khối sợi nấm đông trùng hạ thảo.
2.5.1.3. Nghiên cứu về nuôi trồng nấm Cordyceps militaris trên môi trường nhân tạo
Do nhu cầu tiêu dùng sản phẩm từ Cordyceps militaris ngày càng tăng cùng với đó thì những đặc tính sinh học và chu kì sống Cordyceps militaris còn hạn chếtrong tự nhiên do kí chủ tương đối hiếm, quá trình sinh trưởng diễn ra chậm, sự sinh trưởng bị giới hạn ở một số vùng nhất định, kích thước quả thể nhỏ. Chính vì vậy, để tìm kiếm và sử dụng Cordyceps militaris làm dược phẩm hoặc thực phẩm chức năng là một vấn đề không khả thi (Hong et al., 2010). Kết quả của những nghiên cứu gần đây cho thấy số lượng của Cordyceps militaris trong tự nhiên ngày càng giảm. Chính vì vậy, nghiên cứu về khả năng hình thành và sinh trưởng của quả thể Cordyceps militaris trên môi trường nhân tạo là một vấn đề cần thiết để phục vụ cho nhu cầu của con người.
Đã có rất nhiều nghiên cứu được thực hiện ở phòng thí nghiệm. Những nghiên cứu ban đầu được thực hiện với mục đích đánh giá ảnh hưởng của giai đoạn ấu trùng và giai đoạn nhộng trong chu kỳ sống của tằm Bombyx mori đến hình thành quả thể của nấm Cordyceps militaris (Hong et al., 2010). Và họ cũng các định được 3 giống tằm được xem là phù hợp nhất cho sự hình thành quả thể
của Cordyceps militaris: Daeseungjam, Baegokjam, và Keumokjam. Giống
Daeseungjam và nhộng có tuổi từ 9 đến 11 ngày tuổi, có tỷ lệ nấm xâm nhiễm
100%, trong khi những nhộng có tuổi từ 7 đến 8 ngày tuổi, tỷ lệ xâm nhiễm chỉ đạt 80 % và 76,7%, tương ứng.
Bởi vì côn trùng không phải lúc nào cũng có sẵn, khó xử lý dó đó dễ bị nhiễm vi khuẩn, nấm bệnh nên các dạng cơ chất nền hữu cơ được thử nghiệm cho sản xuất quả thể C. militaris số lượng lớn. Trong đó ngũ cốc có bổ sung một số chất hữu cơ đã được chứng minh sự thay thế hoàn hảo cho côn trùng. Kobayasi (1941), đã chứng minh sự phát triển của C. militaris trên bề mặt môi trường gạo. Kể từ đó, gạo được sử dụng như là thành phần chính cho sự phát triển của quả thể nấm C. militaris.
Dựa trên tiền đề nghiên cứu của Kobayasi trên môi trường gạo. Chất hữu cơ tự nhiên được các nhà nghiên cứu nghĩ tới như một giải pháp thay thế hữu hiệu để nuôi trồng Cordyceps militaris. Theo Shrestha et al. (2012), hạt ngũ cốc là một chất hữu cơ khác được chứng minh là thay thế tốt nhất cho côn trùng. Kể từ đó,
gạo được sử dụng như một thành phần chủ yếu cung cấp dinh dưỡng cho sự sinh trưởng phát dục hình thành quả thể nấm Cordyceps militaris.
Wen et al. (2009), đã nghiên cứu nuôi trồng nấm Cordyceps militaris trên
các loại gạo khác nhau và cho thấy năng suất nuôi quả thể lớn nhất thu được khi sử dụng gạo nâu không trơn bóng. Bên cạnh đó một số chất hữu cơ khác cũng được sử dụng để nuôi trồng Cordyceps militaris bao gồm: bột đậu tương, hạt ngô, vỏ bông, lúa mì, hạt kê, diêm mạch.
Khi sử dụng gạo thay thế côn trùng phải chú ý đến độ xốp của môi trường, độ xốp ảnh hưởng đến sinh trưởng, phát triển của tế bào và năng suất quả thể. Nếu kích thước hạt gạo nhỏ, tỷ lệ nước cao hơn đối với gạo trong quá trình chuẩn bị môi trường, không có khe hở trong cơ chất, hệ sợi của nấm C. militaris chỉ phát triển trên bề mặt môi trường sẽ không thể hấp thụ đủ chất dinh dưỡng phía dưới của nguyên liệu từ phía trên bề mặt môi trường. Độ xốp của môi trường tạo ra các khe hở giúp nấm phát triển trong môi trường để có được dinh dưỡng đầy đủ. Tỷ lệ gạo với nước hợp lý 1:1 đến 1: 1,35 hoặc có thể cao hơn một chút đã được coi là tối ưu cho sản xuất quả thể nấm C. militaris (Zheng et al., 2011), nhưng tỷ lệ tối ưu có thể phụ thuộc vào giống gạo và chất lượng gạo, hamg lượng amylopectin có trong gạo. Gạo lứt thường được lựa chọn để làm giá thể nuôi trồng C. militaris. Tối đa năng suất quả thể thu được khi sử dụng gạo nguyên hạt có bổ sung bột nhộng đã được chứng minh là tốt hơn các chất nền khác và được sử dụng thường xuyên (Shrestha et al., 2004).
Để bổ sung thêm dinh dưỡng đạm cho Cordyceps militaris, các chủng C.
militaris yêu cầu nitơ tương đối thấp, nếu quá cao sẽ ngăn chặn sự hình thành và