Phần 4 Kết quả và thảo luận
4.2. Nghiên cứu sinh trưởng phát triển của 5 chủng nấm đông trùng hạ thảo
4.2.1. Đặc điểm phát triển hệ sợi của 5 chủng nấm C.militaris trong môi trường
trường nhân giống dạng dịch thể
Trong thí nghiệm này, theo định kỳ sẽ lấy giống nấm Cordyceps militaris dịch thể các giai đoạn tuổi giống khác nhau (48, 72, 96, 120, 144 giờ sau cấy) để quan sát. Kết quả quan sát cho thấy trong ngày đầu khoảng 12 – 24h sau khi cấy giống cấp I vào môi trường dung dịch, chưa nhận thấy có hiện tượng gì. Tuy nhiên, sang ngày 2 (từ 24 – 48 giờ) thì bắt đầu xuất hiện các mảnh nấm rất nhỏ, quan sát tiếp ở giai đoạn tuổi giống từ 72 – 96 giờ thì thấy các mảnh nấm nhỏ tăng dần về kích thước rất nhanh, dịch khơng cịn loãng như trước mà đẫ trở thành dạng dịch huyền phù hơn, đó là do sinh khối nấm trong dung dịch đã tăng lên. Theo thời gian các sợi nấm phát triển dài ra và liên kết lại với nhau tạo thành các viên hình cầu, bên cạnh đó trong q trình lắc, sục khí thì do có sự chuyển động va trạm của dịng vật chất trong bình nên có những sợi nấm bị đứt ra và tiếp tục phát triển dài ra rồi lại liên kết lại để tạo thêm nhiều thể hình cầu mới có kích thước khác nhau, các thể hình cầu này gọi là khuẩn lạc cầu (KLC).
4.2.1.1. Sinh khối sợi
Một trong các chỉ tiêu khi theo dõi sự sinh trưởng, phát triển của hệ sợi nấm trong môi trường nhân giống dạng dịch thể đó chính là sinh khối sợi, như đã
được đề cập đến trong phương pháp nghiên cứu sinh khối sợi chính là khối lượng sợi nấm khô thu được từ 1000ml dịch giống nấm dạng dịch thể.
Bảng 4.6. Sinh khối sợi của 5 chủng C. militaris trong môi trường dịch thể qua các giai đoạn
ĐVT: g/l.
Chủng nấm
Thời gian sau cấy giống
48 giờ 72 giờ 96 giờ 120 giờ 144 giờ
ĐT1 0,39 2,00 4,31 8,24 10,02 ĐT2 0,34 2,48 5,26 7,45 8,85 ĐT3 0,40 2,79 6,71 9,23 11,04 ĐT4 0,42 2,75 6,51 9,00 11,08 ĐT5 0,31 2.26 6,04 8,13 9,62 CV % 4,5 3,6 LSD0,05 0,7 0,67
Hình 4.4. Động thái tăng sinh khối sợi của 5 chủng C. militaris trong nhân giống dạng dịch thể
Sau khi xay giống cấp 1 tiến hành đưa giống đã xay nhỏ vào môi trường nhân giống dung dịch đã khử trùng, đặt bình giống lên máy lắc, tiến hành theo dõi sinh khối sợi sau khi cấy giống được 48h sau trở đi. Kết quả được thể hiện trong Bảng 4.5 và mô tả trong đồ thị tăng trưởng ở Hình 4.2 cho thấy trong giai đoạn đầu từ 48h đến 72h do lượng giống mới cấy vào cịn ít nên sinh khối sợi
0 2 4 6 8 10 12 48h 72h 96h 120h 144h ĐT1 ĐT2 ĐT3 ĐT4 ĐT5
chưa cao, tuy nhiên thì ở hai giai đoạn sau đó từ 72h đến 96h và từ 96h đến 120h sinh khối sợi tăng lên rất nhanh, đó là do sau khi giống cấy vào sử dụng nguồn dinh dưỡng trong dịch và oxy được cung cấp khi máy lắc hoạt động tạo ra nhiều tế bào, nhiều sợi nấm mới, bên cạnh đó cịn có sự đứt gẫy của hệ sợi tạo ra hệ sợi mới làm tăng sinh khối trong dung dịch nấm.
Nhưng, giai đoạn 120h – 144h sau thi nhận thấy sinh khối sợi su hướng tăng chậm đó là do các sợi nấm mới được tạo ra sử dụng dinh dưỡng trong dịch làm dinh dưỡng ni sợi, nên có sự cạnh tranh nhau về dinh dưỡng, lượng oxy cũng như thể tích chứa bị thu hẹp lại làm cho hệ sợi nấm trong mơi trường có xu hướng phát triển chậm hơn và đi vào ổn định trước khi chuyển sang giai đoạn đạt cực đại trong điều kiện ni nhất định đó. Đây cũng chính là cơ sở để nhà sản xuất xác định tuổi giống cấy hợp cho quy trình sản xuất C. militaris nhân tạo.
Trong giai đoạn tuổi giống 120h và 144h có hai chủng ĐT3, ĐT4 có sinh khối sợi cao hơn so với ba chủng còn lại. Chủng ĐT3 đạt sinh khối sợi 9,23 g/l ở giai đoạn tuổi giống 120h và có sinh khối 11,04 g/l khi tuổi giống được 144h, chủng ĐT4 có sinh khối sợi 9,00 g/l ở giai đoạn 120h và sinh khối đạt 11,08 khi nuôi giống được 144h kể tù khi cấy giống vào môi trường nhân nuôi.
4.2.1.2. Kích thước khuẩn lạc cầu
Sinh trưởng của nấm trong muôi cấy dịch thể là sinh trưởng theo một chu trình khép kín, gồm 4 giai đoạn: Giai đoạn tiềm phát (Lag phase), giai đoạn Logarit (Log phase), giai đoạn ổn định (Stationary phase) và giai đoạn tử vong (Death phase). Tốc độ phát triển của nấm ở từng giai đoạn phụ thuộc vào nồng độ các chất dinh dưỡng trong môi trường. Sự thiếu hụt về dinh dưỡng trong môi trường là nguyên nhân chính để nấm chuyển từ pha Log phát triển sang pha ổn định Stationary, khi đó sự sinh trưởng dừng lại, khơng có sự thay đổi về số lượng tế bào.
Hai hình thái phát triển của hệ sợi nấm trong môi trường nhân giống dịch thể được nhận định đó là: Hệ sợi nấm (filamentous) và các khuẩn lạc cầu (pellets), trong đó khuẩn lạc cầu được đặc trưng bởi hệ sợi nấm phát triển mạnh, phân nhánh, đan xen bện chặt vào với nhau (Park, 2001).
Mục đích của thí nghiệm này là để mơ tả hình thái của hệ sợi nấm trong quá trình sinh trưởng, phát triển của hệ sợi nấm Cordyceps militaris trong môi
độ lắc là 120 vịng/phút. Hình thái KLC được mơ tả bằng kích thước KLC qua các giai đoạn nhân nuôi thể hiện kết qủa trong Bảng 4.7 và động thái tăng kích thước KLC được mơ tả trên đồ thị Hình 4.3 kích thước KLC tăng dần theo thời gian ni giống, kích thước khơng có sự khác nhau nhiều giữa các chủng tham gia nghiên cứu.
Bảng 4.7. Kích thước khuẩn lạc cầu của 5 chủng C. militaris trong môi trường dịch thể qua các giai đoạn
ĐVT: mm
Chủng nấm
Thời gian sau cấy giống
48 giờ 72 giờ 96 giờ 120 giờ 144 giờ
ĐT1 0,27 0,48 0,86 1,05 1,29 ĐT2 0,25 0,46 0,77 1,11 1,34 ĐT3 0,27 0,54 0,86 1,06 1,32 ĐT4 0,26 0,56 0,87 1,12 1,25 ĐT5 0,29 0,52 0,71 1,11 1,21 CV % 6,5 6,9 6,2 5,1 LSD0,05 0,06 0,10 0,17 0,21
Hình 4.5. Kích thước KLC của 5 chủng C. militaris qua các giai đoạn 4.2.1.3. Mật độ khuẩn lạc cầu trong nhân giống dạng dung dịch 4.2.1.3. Mật độ khuẩn lạc cầu trong nhân giống dạng dung dịch
Trong q trình nhân và ni giống dạng dịch thể, mật độ khuẩn lạc cầu cũng là một trong những chỉ tiêu quan trọng để đánh giá chất lượng giống dịch
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6 48H 72H 96H 120H 144H ĐT1 ĐT2 ĐT3 ĐT4 ĐT5
thể nói chung. Chỉ tiêu này phụ thuộc và nhiều yếu tố khác nhau như: Kích thước và tỷ lệ giống cấy ban đầu, dinh dưỡng môi trường nuôi cấy, độ pH của dung dịch nuôi cấy, tốc độ lắc cũng như cường độ sục khí ảnh hưởng nhiều đến kích thước cũng như mật độ KLC. Theo nghiên cứu của Ngô Xuân Nghiễn và Nguyễn Thị Bích Thùy (2016), về nhân giống dạng dịch thể chủng nấm chân dài, kết quả chỉ ra rằng trong giới hạn cho phép chế độ cấp khí càng cao thì mật độ KLC càng nhiều, sinh khối sợi càng tăng, chế độ sục khí q mạnh thì sinh khối sợi lại giảm, do tốc độ cao tạo ra lực cắt lớn làm giảm sự tăng trưởng của sợi nấm. Để phá thúc đẩy tăng trưởng của sợi nấm thì giống cần được phá vỡ dạng viên mịn, nhưng mặt khác sự cân bằng giữa tăng trưởng và phân đoạn sợi nấm cũng phải phù hợp nếu không sẽ ức chế sinh trưởng của hệ sợi (Marquez et al., 1999).
Bảng 4.8. Mật độ khuẩn lạc cầu của 5 chủng C. militaris trong môi trường dịch thể qua các giai đoạn
Chủng nấm
Thời gian sau cấy giống
48 giờ 72 giờ 96 giờ 120 giờ 144 giờ
ĐT1 + + + + + + + + + + + ĐT2 + + + + + + + + + + + ĐT3 + + + + + + + + + + + + + + + ĐT4 + + + + + + + + + + + + + + + ĐT5 + + + + + + + + + + + Ghi chú: - Số lượng KLC từ 10 – 40 có trong 1 ml dịch: (+) - Số lượng KLC từ 41 – 80 có trong 1 ml dịch: (++) - Số lượng KLC từ 81 – 120 có trong 1 ml dịch: (+++) - Số lượng KLC từ 121 – 150 có trong 1 ml dịch: (++++) - Số lượng KLC trên 150 có trong 1 ml dịch: (+++++)
Qua Bảng 4.8, nhận thấy trong giai đoạn đầu nhân giống mật độ KLC trong dung dịch giống của cả 5 chủng đều rất thấp kết quả này cũng phù hợp với kết nhận được trong Bảng 4.6 và Bảng 4.7 đó là khi mới cấy giống thì kích thước KLC cịn nhỏ, sinh khối sợi trong dịch giống còn thấp nên mật độ KLC cũng rất ít (+ đến + +) tương ứng với số KLC có trong dung dịch giống 10 – 80 KLC/ml. Tuy nhiên các giai đoạn sau đó thì mật độ KLC cũng tăng lên nhanh chóng cho đến 144h sau cấy có hai chủng ĐT3, ĐT4 đã đạt mật độ tối đa (+ + + + +) tương ứng với số lượng KLC > 150 KLC/ml khi nuôi trong mơi trường dung dịch dinh dưỡng SDAY khơng có Agar và bổ sung thêm 5% dịch chiết nhộng tằm.