CHƢƠNG 2 : VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. VẬT LIỆU VÀ ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU
2.1.1. Đối tƣợng nghiên cứu
Đối tƣợng sử dụng trong nghiên cứu này là lồi cỏ biển E. acoroides
(thuộc chi Enhalus) thu hoạch tại đầm Thủy Triều, huyện Cam Lâm, tỉnh
Khánh Hịa, vào tháng 4 năm 2020. Mẫu sau khi thu đƣợc rửa sạch bằng nƣớc biển, chuyển về phịng thí nghiệm và đƣợc phân loại bởi TS. Nguyễn Xuân Vỵ chuyên gia phân loại mẫu thực vật biển, Viện Hải Dƣơng Học. Cỏ biển tƣơi đƣợc tiền xử lý bằng cách ngâm trong cồn 96 độ, ở nhiệt độ phịng khoảng 5-7 ngày để loại bỏ các hợp chất màu và các hợp chất trọng lƣợng phân tử thấp. Sau đĩ, cỏ biển đƣợc lọc tách khỏi dịch chiết cồn và phơi khơ trong khơng khí. Các phần khác nhau của cỏ biển đƣợc tách riêng (rễ, thân gốc và lá) (hình 2.1) cắt nhỏ, ngâm cồn, làm khơ, sau đĩ xay thành bột và bảo quản trong túi nilon buộc kín để sử dụng làm nguyên liệu chiết tách pectin.
Hình 2.1: Các bộ phận của cỏ biển Enhalus acoroides 2.1.2. Dụng cụ - Thiết bị - Hĩa chất 2.1.2. Dụng cụ - Thiết bị - Hĩa chất
2.1.2.1. Dụng cụ
Một số dụng cụ đƣợc sử dụng trong thí nghiệm nhƣ: ống nghiệm, bình tam giác, cốc thủy tinh, ống đong, pipet, cuvet, ống ly tâm, lƣới lọc, giấy lọc…
Lá Rễ Thân gốc
2.1.2.2. Thiết bị
Các thiết bị chính sử dụng trong nghiên cứu bao gồm:
Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC – UV 1200 (Agilent, Mỹ) Thiết bị ghi phổ hồng ngoại: NICOLET IMPACT-410FT-IR
SPECTROMETER.
Máy li tâm siêu tốc: eppendorf, Centrifuge 8504 R
Máy đo quang: HITACHI UV-VIS 2900U SPECTROMETER Máy đo độ nhớt Brookfield DV-E Viscometer
và một số các thiết bị cơ bản trong phịng thí nghiệm.
2.1.2.3. Hĩa chất
Các hĩa chất tinh khiết sử dụng của hãng Sigma (USA) bao gồm: α- amylase, L-rhamnose monohydrate, D-xylose, D-glucose, D-glucuronic acid. EDTA, NaHB4, NH4OH, Na2SO4, TCA (Tricloacetic acid), Gelatin, BaCl2, TFA (Trifluoroacetic acid).
Các hĩa chất tinh khiết sử dụng của hãng Fluka (France) bao gồm: D- galactose, D-mannose, D-arabinose, D-glucose, D-glucuronic acid.
Các hĩa chất tinh khiết sử dụng của hãng Merck (Germany) bao gồm: HCl, K2SO4, NaCl, H2SO4, NaOH, Acetonitrile.
Các hĩa chất cơng nghiệp khác gồm: cồn cơng nghiệp 98 độ. 2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1. Cách tiếp cận các nội dung nghiên cứu đề tài
Nghiên cứu chiết tách và cấu trúc của polysaccharide nĩi chung và của pectin nĩi riêng là hƣớng nghiên cứu tƣơng đối khĩ trên thế giới và cịn mới ở Việt Nam, chỉ đƣợc quan tâm nghiên cứu khoảng hơn thập kỷ trở lại đây. Do vậy, hƣớng tiếp cận sẽ là thƣờng xuyên cập nhật các kết quả nghiên cứu mới trên thế giới, kế thừa các kết quả nghiên cứu của các chuyên gia trong nƣớc và nƣớc ngồi về nghiên cứu polysaccharide biển nĩi chung và của pectin nĩi
riêng. Sử dụng các phƣơng pháp nghiên cứu hiện đại ứng dụng phù hợp vào điều kiện khoa học kỹ thuật thực tiễn ở nƣớc ta để tiến hành triển khai cĩ hiệu quả các nội dung nghiên cứu của đề tài.
Sơ đồ các nội dung nghiên cứu của đề tài đƣợc trình bày (Hình 2.2). Cỏ biển sau khi thu hoạch đƣợc tiến hành xử lý sơ bộ (ngâm trong ethanol 98 độ, phơi khơ). Mẫu cỏ biển sau khi xử lý đƣợc tiến hành tách chiết pectin bằng dung dịch amonium oxalate (theo các phƣơng pháp nghiên cứu trƣớc đây). Tiếp theo, các chỉ tiêu chất lƣợng và thành phần pectin đƣợc xác định bao gồm: thành phần hĩa học của pectin: hàm lƣợng tổng carbohydrate; hàm lƣợng sulfate; hàm lƣợng acid uronic; các chỉ số đặc trƣng: trọng lƣợng tƣơng đƣơng, chỉ số methoxyl (MI), mức độ ester hĩa (DE), hàm lƣợng acid anhydro uronic tổng (AUA), tính chất lƣu biến gel (độ nhớt) và đặc điểm cấu trúc của pectin: thành phần đƣờng đơn và phổ IR từ cỏ biển lá dừa Enhalus acoroides.
Hình 2.2: Sơ đồ khối về nội dung nghiên cứu của đề tài Cỏ biển (Enhalus Cỏ biển (Enhalus acoroides) Xử lý – loại bỏ chất màu Phơi khơ Cắt nhỏ
Chiết trong Amonium oxalate Hợp chất pectin 1. Xác định hàm lƣợng tổng carbohydrate 2. Xác định hàm lƣợng sulfate 3. Xác định hàm lƣợng acid uronic 4. Xác định trọng lƣợng tƣơng đƣơng 5. Xác định chỉ số methoxyl (MI) và hàm
lƣợng acid anhydro uronic tổng (AUA) 6. Xác định mức độ ester hĩa (DE)
7. Đánh giá tính chất lƣu biến gel 8. Xác định thành phần đƣờng đơn 9. Phân tích đặc điểm cấu trúc của pectin
2.2.2. Chiết tách và thu nhận pectin
Kế thừa các tài liệu đã cơng bố về chiết xuất pectin từ cỏ biển cũng nhƣ các lồi thực vật khác [42]; chiết tách pectin từ cỏ biển E.acoroides trong
nghiên cứu này thực hiện theo theo phƣơng pháp đƣợc mơ tả bởi Youjing [49].
2.2.3. Phƣơng pháp xác định tính chất lƣu biến gel của pectin
Để xác định tính chất lƣu biến gel của pectin cĩ thể dựa vào phƣơng pháp xác định độ nhớt của pectin bằng nhớt kế Engle dựa vào thời gian rơi của chất lỏng hoặc sử dụng máy đo độ nhớt Brookfield và đƣợc thực hiện tại phịng thí nghiệm của Viện Nghiên cứu và Ứng dụng cơng nghệ Nha Trang.
2.2.4. Phƣơng pháp xác định thành phần hĩa học của pectin
2.2.4.1. Phương pháp xác định hàm lượng tổng carbohydrate
Phân tích hàm lƣợng tổng carbohydrate: Hàm lƣợng đƣờng tổng đƣợc xác định bằng phƣơng pháp phenol-acid sulfuric [50].
2.2.4.2. Phương pháp xác định hàm lượng Sulfate
Hàm lƣợng sulfate đƣợc phân tích bằng phƣơng pháp đo độ đục với BaCl2/gelatine, sử dụng K2SO4 làm chất chuẩn [52].
2.2.4.3. Phương pháp xác định hàm lượng uronic acid
Hàm lƣợng acid uronic đƣợc xác định sử dụng phƣơng pháp carbazole, sử dụng acid D-gluconic làm chất chuẩn [53].
2.2.4.4. Phương pháp xác định thành phần monosaccharide
Thành phần đƣờng đơn đƣợc xác định bằng phƣơng pháp HPLC, sau khi mẫu pectin đƣợc thủy phân trong mơi trƣờng acid về các dạng các monomer. Các chuẩn đƣờng đơn đƣợc sử dụng: glucose; galactose; rhamnose; mannose; xylose và arabinose [51].
2.2.5. Phƣơng pháp xác định các chỉ số đặc trƣng của pectin
2.2.5.1. Phương pháp xác định trọng lượng tương đương
Trọng lƣợng tƣơng đƣơng đƣợc sử dụng để tính hàm lƣợng AUA tổng và chỉ số ester hĩa, đƣợc xác định theo phƣơng pháp chuẩn độ acid-bazơ, sử dụng phenolphtalein làm chất chỉ thị màu [54].
2.2.5.2. Phương pháp xác định chỉ số methoxyl (MI) và hàm lượng acid
Xác định MI đƣợc thực hiện bằng phƣơng pháp của Ranganna và cộng sự (1995). Từ đĩ tính đƣợc tổng số AUA của pectin thu đƣợc [54].
2.2.5.3. Xác định mức độ ester hĩa (DE)
Mức độ ester hĩa của pectin đƣợc tính dựa trên cơ sở hàm lƣợng methoxyl và AUA [54].
2.2.6. Phƣơng pháp phổ hồng ngoại (IR)
Các mẫu polysaccharide đƣợc tạo viên nén với KBr theo tỉ lệ 10 mg mẫu/20 mg KBr và đo phổ hồng ngoại trên thiết bị FT-IR Bruker tại Viện Cơng nghệ Hĩa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Cơng nghệ Việt Nam.
2.3. THỰC NGHIỆM
2.3.1. Chiết tách và thu nhận pectin từ cỏ biển
Mẫu cỏ biển E.acoroides sau khi thu thập, đƣợc rửa sạch bằng nƣớc
biển. Sau đĩ mẫu đƣợc tiến hành xử lý loại màu, các hợp chất polyphenol và các hợp chất trọng lƣợng phân tử thấp với ethanol 98% theo tỉ lệ 1/10 w/v trong thời gian 7 ngày ở nhiệt độ phịng, hỗn hợp đƣợc lọc tách và cỏ biển đƣợc phơi khơ trong khơng khí ở nhiệt độ phịng.
100 (g) mẫu cỏ biển sau khi đã loại bỏ chất béo và các hợp chất màu đƣợc xử lý trong HCl 0,5% theo tỷ lệ 1/10 w/v ở nhiệt độ 50oC trong thời gian 3 giờ để phá vỡ thành tế bào và giải phĩng polysaccharide khỏi các liên kết trong thành tế bào. Dịch xử lý đƣợc lọc tách thơ qua vải lọc, phần nguyên liệu cỏ biển sau xử lý đƣợc rửa lại bằng nƣớc máy để loại bỏ acid trƣớc khi tiến hành chiết tách thu nhận pectin. Phần dịch xử lý acid đƣợc trung hịa bằng dung dịch NaOH 0,5% và thu nhận polysaccharide trong phân đoạn này bằng kết tủa ở nồng độ cồn 70% (F1).
Cỏ biển sau khi đƣợc xử lý với HCl 0,5% đƣợc đem chiết với dung dịch amonium oxalate 2% ở nhiệt độ 70oC trong thời gian 3 giờ (lặp lại 2 lần với các điều kiện tƣơng tự). Dịch chiết của 2 lần chiết đƣợc gộp lại, lọc tách thơ qua vải lọc, sau đĩ lọc lại bằng giấy lọc. Dịch chiết sau đĩ đƣợc acid hĩa bằng dung dịch HCl 1N đến pH = 1-2 thu đƣợc kết tủa dạng keo là các pectin
dạng acid và để lắng qua đêm. Tiếp theo, gạn bỏ phần dịch trong, kết tủa đem ly tâm ở 7.000 vịng/phút trong 10 phút. Tách phần kết tủa keo đem hịa tan lại trong dung dịch Amonium oxalate 2% và điều chỉnh về pH = 7, pectin trong dung dịch đƣợc kết tủa bằng cồn 98% theo tỷ lệ v/v = 1/4, để lắng 1–2 giờ. Thu kết tủa bằng ly tâm và rửa sạch bằng cồn 75% (2-3 lần rửa) và rửa lại bằng cồn 98%. Sau đĩ đem sấy khơ qua đêm ở nhiệt độ 50oC và thu đƣợc sản phẩm polysaccharide dạng thơ cĩ chứa pectin (F2).
Hàm lƣợng % pectin (phân đoạn F2) đƣợc tính theo cơng thức sau [54]:
%pectin Wt 100
Ws
Trong đĩ: Wt: khối lƣợng pectin sau khi chiết (g) Ws: khối lƣợng mẫu cỏ biển ban đầu (g)
2.3.2. Xác định tính chất lƣu biến gel của pectin
Hịa tan 10g mẫu pectin thơ vào 250mL nƣớc cất, khuấy tan mẫu và sử dụng máy đo độ nhớt Brookfield DV-E Viscometer với kim S62, đƣợc thực hiện ở các vịng quay từ 30 – 100rpm (vịng/phút). Kết quả đƣợc hiển thị trên màn hình của máy.
2.3.3. Xác định hàm lƣợng tổng carbohydrate
Tổng carbohydrate đƣợc xác định bằng phƣơng pháp so màu với thuốc thử phenol/sulfuric acid [50]: cân chính xác 10 mg mẫu và pha trong 1 ml nƣớc cất, lắc mạnh để mẫu hịa tan hồn tồn, ly tâm, lấy dịch. Sau đĩ, tiến hành pha lỗng dung dịch 10 lần và sử dụng để xác định hàm lƣợng đƣờng tổng. Lấy 500 µl dung dịch cần xác định, thêm vào 500 µl thuốc thử phenol 5% lắc đều đến khi dung dịch trở nên trong suốt. Tiếp theo, thêm tiếp 2 ml acid sulfuric đậm đặc lắc đều rồi đem đun cách thủy trong thời gian 10-15 phút, lấy ra để nguội, phức chất cĩ màu vàng và đƣợc đo độ hấp thụ quang ở bƣớc sĩng λ = 490 nm. Sử dụng D-glusose làm chất chuẩn [50].
2.3.4. Xác định hàm lƣợng sulfate
Hàm lƣợng sulfate đƣợc xác định bằng phƣơng pháp đo độ đục với BaCl2/gelatin [52], cụ thể nhƣ sau: cân chính xác 10 mg mẫu và pha trong 1 ml nƣớc cất, lắc mạnh để mẫu hịa tan hồn tồn. Sau đĩ, tiến hành pha lỗng dung dịch 10 lần và sử dụng để xác định hàm lƣợng sulfate. Lấy 500 μl dung dịch mẫu sau thủy phân, thêm vào 1,5mL TCA 4% (acid trichlorua acetic) và 1,5mL hỗn hợp (0,5% gelatin + 0,5% BaCl2) lắc đều, phức chất cĩ màu trắng đục và đƣợc đo độ hấp thụ quang ở bƣớc sĩng λ= 360 nm. Hàm lƣợng sulfate đƣợc tính dựa vào đƣờng chuẩn dựng từ dung dịch K2SO4 với khoảng nồng độ từ 50 – 250µg/ml [52].
2.3.5. Xác định hàm lƣợng uronic acid
Hàm lƣợng uronic acid đƣợc xác định bằng phƣơng pháp carbazole [53]. Cân chính xác 10 mg mẫu và pha trong 1 ml nƣớc cất, lắc mạnh để mẫu hịa tan hồn tồn. Sau đĩ, tiến hành pha lỗng dung dịch 10 lần và sử dụng để xác định hàm lƣợng acid uronic. Lấy 500 μl dung dịch mẫu đã đƣợc chuẩn bị ở trên cho vào ống nghiệm. Tiếp theo, thêm vào 3 ml dung dịch A (0,9 g NaBH4 hịa tan trong 10 ml nƣớc cất + 90 ml dung dịch acid sulfuric 98%). Phản ứng đƣợc tiến hành ở 100oC trong thời gian 10 phút. Kết thúc phản ứng, hỗn hợp đƣợc làm lạnh nhanh trong nƣớc đá. Sau đĩ, thêm tiếp 200μl dung dịch B (100 mg carbazole đƣợc hịa tan trong 100 ml cồn tuyệt đối) vào hỗn hợp và tiến hành lắc đều để thực hiện phản ứng lại ở 100o
C trong 15 phút. Cuối cùng, hỗn hợp phản ứng đƣợc làm lạnh nhanh đến nhiệt độ phịng, phức chất cĩ màu hồng tƣơi và tiến hành đo độ hấp thụ quang ở bƣớc sĩng λ = 530 nm. Sử dụng D – glucuronic acid làm chất chuẩn với khoảng nồng độ từ 20 – 200 µg/ml [53].
2.3.6. Xác định thành phần monosaccharide
Phân tích thành phần các đƣờng đơn của pectin là bƣớc quan trọng đầu tiên trong nghiên cứu cấu trúc của pectin. Quy trình chung để xác định các đƣờng đơn là thủy phân pectin thành các monosacaride và sau đĩ phân tích thành phần của từng monosacaride bằng phƣơng pháp sắc ký. Phƣơng pháp
sắc ký phổ biến nhất đƣợc sử dụng để phân tích thành phần các đƣờng đơn là phân tích trực tiếp bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) [50].
Mẫu pectin (5 mg) cho vào ống nghiệm cĩ nút vặn dung tích 5 ml, thêm 1 ml TFA (Triflorua acetic acid) 2M lắc đều cho tan, đem thủy phân ở 100oC trong 6 giờ sau đĩ cho bay hơi đến gần khơ bằng máy cơ quay chân khơng, rửa lặp lại 3 lần với MeOH để đuổi hết TFA dƣ. Phần cặn cịn lại hịa tan với 1 ml nƣớc khử ion, dung dịch này đƣợc dùng để phân tích thành phần đƣờng đơn bằng HPLC – UV (Agilent, USA), sử dụng cột C18 Zorbax Eclipse XBD (150mm x 4,6mm; 3,5µm), pha động là amonium acetate 20mmol/L (A) và acetonitrile (B) với tốc độ dịng 1ml/phút để rửa giải theo tỷ lệ: 0-1 phút: 13 – 15% (B); 1-40 phút: 16% (B) và đƣợc đo ở bƣớc sĩng λ = 245nm [55]. Các đƣờng đơn: glucose; galactose; rhamnose; mannose; xylose và arabinose đƣợc sử dụng là chất chuẩn. Hàm lƣợng các thành phần đƣờng đơn đƣợc tính theo %w/w dựa vào các chất chuẩn trên.
2.3.7. Xác định các chỉ số đặc trƣng của pectin
2.3.7.1. Xác định trọng lượng tương đương
Cân 0,5 g mẫu pectin cho vào bình tam giác. Tiếp theo cho thêm 5 ml ethanol 98% và 100 ml NaCl 1%. Cuối cùng, thêm 6 giọt dung dịch phenolphtalein 1% vào hỗn hợp và chuẩn độ với NaOH 0,1N đến khi màu hồng xuất hiện thì ngừng, ghi lại thể tích NaOH đã dùng [54]. Từ đĩ tính đƣợc trọng lƣợng tƣơng đƣơng nhƣ sau:
1000 NaOH NaOH W EW V C Trong đĩ: EW: trọng lƣợng tƣơng đƣơng
W: khối lƣợng mẫu
VNaOH: thể tích NaOH tiêu tốn CNaOH: nồng độ NaOH 0,1N
Dung dịch thu đƣợc sau khi trung hịa đƣợc giữ lại để tiếp tục xác định chỉ số methoxyl.
2.3.7.2. Xác định chỉ số methoxyl (MI) và hàm lượng acid anhydro uronic tổng (AUA) uronic tổng (AUA)
Sử dụng dung dịch đã đƣợc trung hịa ở thí nghiệm trên và thêm 25 ml sodium hydroxide 0,25N, khuấy đều và giữ ở nhiệt độ phịng 30 phút. Sau đĩ, thêm 25 ml HCl 0,25N và chuẩn độ bằng NaOH 0,1N. Ghi lại thể tích NaOH tiêu tốn [54]. Chỉ số MI đƣợc tính theo cơng thức: 3.1 % VNaOH CNaOH MI W
Hàm lƣợng AUA đƣợc tính theo cơng thức [54]: 176 0.1 100 176 0.1 100 % 1000 1000 z y AUA W W
Trong đĩ: 1 đơn vị AUA = 176g
z: VNaOH từ xác định trọng lƣợng tƣơng đƣơng y: VNaOH tiêu tốn xác định chỉ số MI
W: khối lƣợng mẫu phân tích
2.3.7.3. Xác định mức độ ester hĩa (DE)
Dựa trên số liệu thu đƣợc từ chỉ số methoxyl và AUA tổng, mức độ ester hĩa (DE) đƣợc xác định theo cơng thức sau [54]:
176 % % 100 31 % MI DE AUA 2.4. PHƢƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU
Tất cả các thí nghiệm đƣợc tiến hành 2 lần độc lập, kết quả đƣợc thể hiện là giá trị trung bình. Sử dụng phần mềm Microsoft Excel 2010 để tính tốn số liệu và vẽ đồ thị.
CHƢƠNG 3 : KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. CHIẾT TÁCH VÀ THU NHẬN PECTIN
Pectin từ cỏ biển E. acoroides đƣợc chiết tách và thu nhận phân đoạn
theo các dung dịch chiết khác nhau, phân đoạn F1 đƣợc chiết trong dung dịch acid HCl lỗng và phân đoạn F2 đƣợc chiết trong dung dịch amonium oxalat. Trong nghiên cứu này pectin đƣợc thu nhận từ các phần gồm: rễ, gốc và lá của cỏ biển nhằm đánh giá sự phân bố của pectin trong mỗi bộ phận khác nhau của cỏ biển. Kết quả chỉ ra hàm lƣợng pectin cĩ sự khác biệt rất lớn giữa phân đoạn F1 và F2 trong cả rễ, gốc và lá (Hình 3.1). Phân đoạn F1 dao động từ 1,8 - 3,6%, thấp nhất ở bộ phận gốc (1,8%) và cao nhất trong bộ phận lá (3,6%). Trong khi đĩ, phân đoạn F2 cĩ hàm lƣợng pectin cao hơn nhiều so với phân đoạn F1, trong khoảng từ 10,5% đến 24,2%. Nhƣ vậy, cĩ thể thấy cả 02 phân đoạn pectin cĩ phân bố nhiều nhất trong lá (3,6% F1 và 24,2% F2), phân đoạn F2 phân bố ở rễ và gốc khác nhau khơng nhiều lần lƣợt là 10,5%