Dựa trên số liệu thu đƣợc từ chỉ số methoxyl và AUA tổng, mức độ ester hĩa (DE) đƣợc xác định theo cơng thức sau [54]:
176 % % 100 31 % MI DE AUA 2.4. PHƢƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU
Tất cả các thí nghiệm đƣợc tiến hành 2 lần độc lập, kết quả đƣợc thể hiện là giá trị trung bình. Sử dụng phần mềm Microsoft Excel 2010 để tính tốn số liệu và vẽ đồ thị.
CHƢƠNG 3 : KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. CHIẾT TÁCH VÀ THU NHẬN PECTIN
Pectin từ cỏ biển E. acoroides đƣợc chiết tách và thu nhận phân đoạn
theo các dung dịch chiết khác nhau, phân đoạn F1 đƣợc chiết trong dung dịch acid HCl lỗng và phân đoạn F2 đƣợc chiết trong dung dịch amonium oxalat. Trong nghiên cứu này pectin đƣợc thu nhận từ các phần gồm: rễ, gốc và lá của cỏ biển nhằm đánh giá sự phân bố của pectin trong mỗi bộ phận khác nhau của cỏ biển. Kết quả chỉ ra hàm lƣợng pectin cĩ sự khác biệt rất lớn giữa phân đoạn F1 và F2 trong cả rễ, gốc và lá (Hình 3.1). Phân đoạn F1 dao động từ 1,8 - 3,6%, thấp nhất ở bộ phận gốc (1,8%) và cao nhất trong bộ phận lá (3,6%). Trong khi đĩ, phân đoạn F2 cĩ hàm lƣợng pectin cao hơn nhiều so với phân đoạn F1, trong khoảng từ 10,5% đến 24,2%. Nhƣ vậy, cĩ thể thấy cả 02 phân đoạn pectin cĩ phân bố nhiều nhất trong lá (3,6% F1 và 24,2% F2), phân đoạn F2 phân bố ở rễ và gốc khác nhau khơng nhiều lần lƣợt là 10,5% và 10,9%. Hàm lƣợng pectin phân đoạn (F2) phân bố trong rễ và gốc cỏ biển
E. acoroides tƣơng đƣơng với hàm lƣợng pectin ở một số lồi cỏ biển khác
trên thế giới nhƣ: cỏ Zostera caespitosa Miki (10,8%) [56]; Zostera marina
(10-11%), Zostera pacifica (12%) [12, 29], và cao hơn so với hàm lƣợng pectin từ cỏ Phyllospadix iwatensis (6,91%) [31]. So với pectin cĩ nguồn gốc từ thực vật trên cạn, hàm lƣợng pectin cũng cĩ sự khác biệt đáng kể nhƣ: hàm lƣợng pectin từ vỏ chanh (10,3-13,13%) [32], vỏ chanh dây (2,25-14,6%) [34], vỏ măng cụt Indonesia (1,16%) [35], vỏ cam (7,3-16,0%) [33]. Nhƣ vậy, cĩ thể thấy hàm lƣợng pectin biến đổi phụ thuộc vào nhiều yếu tố gồm loại nguyên liệu, nguồn gốc địa lý, thời kỳ thu hoạch, phƣơng pháp chiết và điều kiện chiết [32, 33,56]. Sự biến đổi về hàm lƣợng polysaccharide giữa các lồi cĩ thể đƣợc giải thích là do sự khác biệt cấu trúc thành tế bào, cũng nhƣ điều kiện mơi trƣờng sống của mỗi lồi cỏ biển khác nhau. Ngồi ra, các kỹ thuật
chiết tách cũng ảnh hƣởng đến việc thu nhận polysaccharide, do vậy sử dụng các phƣơng pháp chiết tách khác nhau dẫn đến việc thu đƣợc các hàm lƣợng polysaccharide khác nhau. Nhìn chung, polysaccharide ở mỗi lồi cỏ biển khơng chỉ khác nhau về hàm lƣợng mà thành phần hĩa học và các đặc trƣng cấu trúc cũng rất khác nhau và tạo nên sự đa dạng rất lớn về cấu trúc hĩa học và hoạt tính sinh học [57].
Hình 3.1: Sự phân bố hàm lƣợng pectin trong cỏ biển E.acoroides
Hình 3.2: Các giai đoạn xử lý cỏ biển. a) Mẫu cỏ biển sau khi loại bỏ
Hình 3.3: Dịch chiết pectin. a) Dịch keo pectin chiết từ cỏ biển;
b) Dịch chiết pectin tủa trong cồn
Hình 3.4: Chế phẩm pectin thơ sau khi sấy khơ
3.2. XÁC ĐỊNH MỘT SỐ TÍNH CHẤT HĨA LÝ CỦA PECTIN
Chất lƣợng pectin thu nhận từ các nguồn nguyên liệu khác nhau thơng thƣờng đƣợc đánh giá thơng qua các thơng số: một số thành phần hĩa học của pectin (tổng carbohydrate, acid uronic, thành phần đƣờng đơn, sulfate), một
số chỉ số đặc trƣng của pectin (trọng lƣợng tƣơng đƣơng, chỉ số methoxyl hĩa (MI), acid anhydro uronic tổng (AUA) và mức độ ester hĩa (DE)). Trong phạm vi nghiên cứu của đề tài, đã xác định đƣợc một số thành phần đặc trƣng sau: hàm lƣợng tổng carbohydrate, hàm lƣợng acid uronic, hàm lƣợng sunfate, thành phần đƣờng đơn và các chỉ số đặc trƣng của pectin nhƣ: trọng lƣợng tƣơng đƣơng, chỉ số methoxyl hĩa (MI), acid anhydro uronic tổng (AUA) và mức độ ester hĩa.
3.2.1. Tính chất lƣu biến gel của pectin
Petin là một hợp chất tạo gel khá quan trọng đƣợc sử dụng để tạo ra cấu trúc gel cho thực phẩm, khả năng tạo gel dựa vào đƣờng và acid cĩ trong thành phần của sản phẩm. Trong nội dung nghiên cứu này của luận văn do hàm lƣợng pectin cĩ nhiều nhất trong phần lá, nên pectin từ phần lá đƣợc lựa chọn làm đại diện cho đánh giá tính chất lƣu biến gel. Kết quả xác định giá trị độ nhớt thu đƣợc là 4 - 5Cps (Centipoise-đơn vị độ nhớt). Kết quả này chỉ ra giá trị khối lƣợng phân tử trung bình của pectin từ E. acoroides là thấp hơn
nhiều so với khối lƣợng phân tử của pectin từ cỏ biển Zostera caespitosa Miki [56].
3.2.2. Thành phần hĩa học của pectin
3.2.2.1. Hàm lượng tổng carbohydrate và acid uronic
Pectin là một polysaccharide cĩ thành phần hĩa học phức tạp, thành phần chính thƣờng là galacturonic acid, cùng với nhiều gốc đƣờng khác nhƣ rhamnose, xylose, arabinose, glucose,... [50, 53]. Vì vậy, xác định thành phần hĩa học của pectin, đầu tiên các mẫu pectin đƣợc tiến hành xác định hàm lƣợng tổng carbohydrate và hàm lƣợng acid uronic cĩ trong pectin. Kết quả phân tích thành phần carbohydrate và acid uronic đƣợc trình bày (hình 3.5 và 3.6) và đƣợc tính dựa trên đƣờng chuẩn của glucose và acid D-glucuronic
(Bảng 3.1 và bảng 3.2). Hàm lƣợng tổng carbohydrate dao động trong khoảng từ 24,87% (F2-Gốc) đến 39,81% (F1-Rễ) (Bảng 3.3). Hàm lƣợng tổng carbohydrate của các phân đoạn F1 cao hơn F2 và trong cùng phân đoạn thì hàm lƣợng tổng carbohydrate đƣợc phân lập từ rễ cao hơn so gốc và lá.
Bảng 3.1: Các giá trị mật độ quang mẫu chuẩn xác định hàm lƣợng
carbohydrate tổng bằng phƣơng pháp phenol – acid sulfuric
Nồng độ carbohydrate (µg/ml) λ = 490nm A1 A2 Atb 50 0,5077 0,5078 0,5078 100 1,0155 1,0155 1,0155 150 1,5460 1,5462 1,5461 200 1,8294 1,8300 1,8297 Hình 3.5: Đƣờng chuẩn xác định hàm lƣợng carbohydrate
Bảng 3.2: Các giá trị mật độ quang của mẫu chuẩn xác định hàm lƣợng
uronic acid bằng phƣơng pháp Carbazole
Nồng độ uronic acid (µg/ml) λ = 525nm A1 A2 Atb 20 0,0979 0,0979 0,0979 50 0,2149 0,2149 0,2149 100 0,3911 0,3907 0,3909 150 0,5904 0,5914 0,5909 200 0,7894 0,7885 0,7890
Hình 3.6: Đƣờng chuẩn xác định hàm lƣợng uronic acid
Theo các nghiên cứu trƣớc đây về pectin cĩ trong cỏ biển, pectin chiết từ cỏ biển E. acoroides tại biển Khánh Hịa cĩ hàm lƣợng tổng carbohydate và acid uronic thấp hơn so với pectin đƣợc chiết xuất từ cỏ biển Z. marina với hàm lƣợng tổng carbohydrate chiếm 38,8%; acid uronic chiếm 38% [12] và lồi Phyllospadix tƣơng ứng là 39,45% (carbohydrate) và 40% (acid uronic)
độ tinh sạch cao thì hàm lƣợng carbohydrate, acid uronic phải đạt 30% trở lên. Trong đề tài nghiên cứu này, pectin thu từ cỏ biển E. acoroides cĩ hàm
lƣợng carbohydrate tổng xấp xỉ 30%. Tuy nhiên, điều này cĩ thể đƣợc giải thích do sự khác biệt về chủng lồi cỏ biển và đặc trƣng cấu trúc của pectin từ các lồi khác nhau, bên cạnh đĩ các kỹ thuật tách chiết, tinh chế cũng ảnh hƣởng tới thành phần hĩa học sản phẩm pectin đƣợc thu nhận.
Bảng 3.3: Thành phần hĩa học của pectin từ E. acoroides
Thành phần F1 F2
Rễ Gốc Lá Rễ Gốc Lá
Tổng carbohydrate % 39,81 34,61 37,41 28,30 24,87 27,41
Sulfate % - 37,7 27,9 - - -
Uronic acid % 4,13 9,38 5,73 7,14 7,88 6,19
3.2.2.2. Hàm lượng sulfate
Polysaccharide cỏ biển ngồi thành phần pectin (pectic polysaccharide) cịn cĩ các thành phần polysaccharide khác bao gồm cả polysaccharide sulfate. Do dĩ, việc xác định sự cĩ mặt của sulfate nhằm đánh giá phân đoạn chiết tách pectin cĩ lẫn thành phần polysaccharide này hay khơng. Hàm lƣợng sulfate đƣợc xác định dựa trên phƣơng pháp đo độ đục với chất chuẩn là K2SO4. Kết quả xác định hàm lƣợng sulfate của các mẫu polysaccharide đƣợc đƣa ra trong bảng 3.3.
Bảng 3.4: Các giá trị mật độ quang của mẫu chuẩn xác định hàm lƣợng
sulfate Nồng độ sulfate (µg/ml) λ = 360nm A1 A2 Atb 50 0,2649 0,2647 0,2648 100 0,3933 0,3930 0,3932 150 0,5071 0,5072 0,5071 200 0,6086 0,6086 0,6086 250 0,6876 0,6868 0,6872
Hình 3.8: Đƣờng chuẩn xác định hàm lƣợng Sulfate
Kết quả trong bảng 3.3 cho thấy sulfate chỉ đƣợc phát hiện trong 02 phân đoạn F1 ở gốc và lá với hàm lƣợng tƣơng ứng là 37,7% và 27,9%; các phân đoạn F2 và F1ở bộ phận rễ khơng phát hiện thấy sự cĩ mặt của nhĩm sulfate (Bảng 3.3). Các mẫu pectin (phân đoạn F2) khơng phát hiện thấy sự cĩ mặt của nhĩm sulfate, chứng tỏ trong các phân đoạn này khơng cĩ lẫn polysaccharide sulfate. Kết quả này cĩ thể thể giải thích là trong quá trình xử lý acid, tồn bộ polysaccharide sulfate đã đƣợc tách ra trong phân đoạn chiết này. Nhƣ vậy, mẫu pectin thu nhận từ cỏ biển E. acoroides đã đƣợc phân lập một cách trọn lọc khi đƣợc xử lý trong dung dịch acid lỗng trƣớc khi phân lập dƣới dạng pectic polysaccharide hịa tan khi đƣợc chiết bằng dung dịch amonium oxalate, kết quả này cho thấy sự phù hợp với các nghiên cứu trƣớc đây [58].
3.2.2.3. Thành phần đường đơn
Phân tích xác định thành phần của các monosaccharide là việc quan trọng đầu tiên trong việc nghiên cứu cấu trúc của các polysaccharide nĩi chung và của pectin nĩi riêng. Pectin là một polymer dị thể cĩ thành phần hĩa
học phức tạp, ngồi hai thành phần chính là fucose và sulfate, chúng cịn chứa các đƣờng đơn khác nhƣ galactose, mannose, xylose, glucose, rhamnose... và uronic acid. Vì vậy, để xác định thành phần hĩa học của pectin, mẫu sẽ đƣợc thủy phân thành các monomer trong mơi trƣờng acid. Việc thủy phân hồn tồn để xác định thành phần các đƣờng đơn của pectin trên thực tế rất khĩ xảy ra, do đĩ tơi tiến hành xác định tỉ lệ phần trăm về khối lƣợng giữa các gốc đƣờng đã đƣợc thủy phân và dựa vào tổng carbohydrate để tính thành phần của mỗi đƣờng đơn trong mẫu pectin. Sắc ký đồ của các mẫu đƣờng chuẩn và mẫu pectin trong phân đoạn F2 ở bộ phận lá đƣợc trình bày trên hình 3.9 và hình 3.10.
Hình 3.9: Sắc ký đồ HPLC của các mẫu đƣờng đơn chuẩn
Trong nghiên cứu này, các kết quả đánh giá ở trên cho thấy pectin cĩ phân bố chủ yếu trong thành phần lá nên phân đoạn pectin từ lá đƣợc lựa chọn đại diện cho đánh giá thành phần đƣờng đơn cũng nhƣ đánh giá một số đặc trƣng cấu trúc của pectin từ cỏ E. acoroides. Kết quả phân tích thành phần
monosaccharide của mẫu pectin (F2-lá) đƣợc thể hiện trong bảng 3.5.
Bảng 3.5: Thành phần monosaccharide của pectin từ các lồi khác nhau
Mẫu
Thành phần monosacchride của pectin (%w/w)
Mannose Rhamnose Glucose Xylose Galactose Arabinose Cỏ biển E.acoroides (F2 - lá) 0,86 1,01 23,23 0,65 2,02 0,75 Cỏ biển Zostera caespitosa Miki 4,20 11,80 - 4,40 6,00 4,30 Bã chanh 4,13 9,64 4,12 0,03 3,54 3,54
Kết quả trong bảng 3.5 cho thấy mẫu pectin (F2-lá) cĩ thành phần chính là glucose (23,23%) và cĩ một số thành phần đƣờng khác với hàm lƣợng nhỏ hơn gồm: galactose (2,02%); rhamnose (1,01%); mannose (0,86%); arabinose (0,75%) và xylose (0,65%). Kết quả này chỉ ra sự đa dạng cao về thành phần đƣờng đơn, và dự đốn sự đa dạng về cấu trúc của pectin cỏ E. acoroides.
Theo Youjing và cộng sự, mẫu pectin từ cỏ biển Zostera caespitosa
Miki [49] cĩ chứa các gốc đƣờng nhƣ rhamnose (11,8%); galactose (6,0%); xylose (4,4%); arabinose (4,3%); mannose (4,2%) và khơng cĩ thành phần
glucose trong mẫu. Mặc khác, Azad và cộng sự cũng xác định đƣợc thành phần đƣờng đơn cĩ trong pectin đƣợc chiết từ bã chanh [32] nhƣ rhamnose (9,64%); mannose và glucose (4,13% và 4,12%); galactose và arabinose (3,54%) và một lƣợng nhỏ khơng đáng kể xylose (0,03%). Nhƣ vậy, chúng ta cĩ thể nhận thấy, tỉ lệ giữa các gốc đƣờng giữa các lồi cỏ biển khác nhau thì khơng giống nhau và đặc biệt theo nhĩm tác giả này, thành phần đƣờng của pectin trong cỏ biển Z. caespitosa Miki lại khơng cĩ gốc đƣờng glucose, trong khi đĩ thành phần chính của đƣờng đơn từ mẫu pectin của cỏ biển
E.acoroides là gốc đƣờng glucose. Nhƣ vậy, hàm lƣợng các gốc đƣờng này
biến đổi theo từng chi và từng lồi cỏ biển. Các kết quả này cũng hồn tồn phù hợp với các cơng bố trƣớc đĩ về sự đa dạng của thành phần hĩa học của pectin. Kết quả phân tích thành phần đƣờng chỉ ra rằng pectin của các lồi cỏ biển thuộc các chi khác nhau là khác nhau về thành phần và tỉ lệ phần trăm giữa các gốc đƣờng đơn. Những đặc điểm này tạo ra sự đa dạng cấu trúc cũng nhƣ hoạt tính sinh học của pectin, nhƣng đồng thời cũng làm cho việc phân tích chi tiết cấu trúc của pectin trở nên vơ cùng phức tạp. Đĩ chính là lý do tại sao cho đến nay trên thế giới mới chỉ cĩ một vài cơng bố về cấu trúc hồn chỉnh của pectin, nhƣng chƣa cĩ một cơng bố nào đƣa ra đƣợc mối liên hệ cĩ tính quy luật cho cấu trúc pectin với các lồi cỏ biển.
Sự khác nhau này cĩ thể đƣợc giải thích do sự khác nhau về vị trí, thời gian thu mẫu và điều kiện mơi trƣờng sống. Điều này cho thấy thành phần cũng nhƣ đặc điểm cấu trúc của pectin vơ cùng phức tạp.
3.2.3. Các chỉ số đặc trƣng tính chất hĩa lý của pectin
3.2.3.1. Trọng lượng tương đương
Trọng lƣợng tƣơng đƣơng của pectin đƣợc chiết xuất từ rễ, thân và lá của cỏ biển E. acoroides từ 2300 – 2500 g/mol (phân đoạn F1) và từ 1500 – 1900 g/mol (đối với phân đoạn F2) (Bảng 3.6). Trong nghiên cứu này, trọng
lƣợng tƣơng đƣơng của pectin thu đƣợc từ cỏ biển E.acoroides cao hơn một
số lồi thực vật trên cạn khác nhƣ: 1632 g/mol [32]; 1666 g/mol [59]; 645 g/mol [60] nhƣng trong măng cụt Indonesia khá cao 6330 g/mol [35]. Trọng lƣợng tƣơng đƣơng của pectin là một chỉ số khác về khả năng tạo gel của nĩ, với pectin cĩ trọng lƣợng phân tử cao cĩ khả năng tạo gel tốt hơn [61]. Tuy nhiên, trọng lƣợng tƣơng đƣơng thu đƣợc thấp cĩ thể là do sự suy giảm một phần của pectin trong điều kiện chiết tách khác nhau. Trọng lƣợng tƣơng đƣơng tăng hay giảm cũng phụ thuộc vào lƣợng acid tự do cĩ trong phân tử pectin [60].
3.2.3.2. Hàm lượng AUA
Hàm lƣợng AUA là chỉ số đánh giá độ tinh khiết của pectin chiết xuất từ nguồn nguyên liệu tự nhiên và sản phẩm pectin cĩ độ tinh khiết cao thì chỉ số AUA tổng phải lớn hơn 65% [49]. Trong nghiên cứu này, hàm lƣợng AUA cĩ trong phần rễ, thân và lá tƣơng ứng từ 25 – 34% đối với phân đoạn F1 và từ 27 – 41% (Bảng 3.6). Nhƣ vậy, so với tiêu chuẩn về hàm lƣợng AUA, thì mẫu pectin thu đƣợc từ cỏ biển E. acoroides thấp hơn so với yêu cầu về độ
tinh khiết. Điều này cĩ thể giải thích đƣợc trong quá trình tách chiết thu mẫu pectin cĩ thể do một số yếu tố khách quan nhƣ dụng cụ, mơi trƣờng và kỹ thuật chiết chƣa đƣợc tối ƣu nên dẫn đến hàm lƣợng thu đƣợc khơng cao.
3.2.3.3. Hàm lượng methoxyl và ester hĩa
Hai chỉ số methoxyl (MI) và ester hĩa (DE) đƣợc sử dụng phổ biến để đánh giá tính chất đặc trƣng của pectin. Và trong nghiên cứu này, hai chỉ số MI và DE của pectin thu nhận từ phần rễ, thân gốc và lá của cỏ biển E. acoroides đƣợc xác định dựa trên trọng lƣợng tƣơng đƣơng đã đề cập ở phần
Kết quả xác định hai chỉ số là methoxyl (MI) và ester hĩa (DE) đƣợc thể hiện trong bảng 3.6. Chỉ số MI của phần rễ, thân và lá từ 3 – 5% ở cả 2 phân đoạn; trong khi đĩ, chỉ số DE ở phần thân đạt 76 – 78% ở phân đoạn F1 và F2 cao hơn so với rễ và lá lần lƣợt là 64 – 67% (F2).
Nhƣ vậy, qua kết quả nghiên cứu cũng cho thấy chỉ số MI xấp xỉ 7% và chỉ số DE lớn hơn 50%. Căn cứ vào tiêu chuẩn chất lƣợng của pectin dựa trên hai chỉ số ME và DE, pectin thu đƣợc từ cỏ biển E. acoroides thuộc loại
pectin cĩ ester hĩa cao.
Theo các kết quả nghiên cứu trƣớc đây, pectin thu nhận từ hai lồi cỏ biển Z. marina và Phyllospadix iwatensis cĩ chỉ số DE lần lƣợt là 7,9% và
10,2% [12, 31]; những giá trị này thấp hơn nhiều so với pectin thu từ cỏ biển
E. acoroide (64-67%). Nhƣ vậy, pectin thu nhận từ cỏ biển E. acoroide trong
nghiên cứu hiện tại cĩ chỉ số DE khá cao so với các lồi cỏ biển đã đƣợc nghiên cứu và đƣợc cơng bố trƣớc đĩ. Cĩ thể nĩi cỏ biển thu nhận tại vùng biển Khánh Hịa cĩ những tính chất đặc trƣng khác so với những lồi cỏ biển đã đƣợc nghiên cứu trên thế giới. Sự khác nhau này cĩ thể đƣợc giải thích nhƣ