mà ở đĩ cĩ khả năng tích lũy chất độc nhiều nhất. Thơng thường, sau khi vào cơ thể các chất độc được lưu trữ trong gan, máu, nước tiểu, dịch dạ dày.
Tùy thuộc vào mục đích nghiên cứu, khảo sát mà phải lấy riêng từng loại phủ tạng hoặc lấy nhiều loại phủ tạng khác nhau và xác định khối lượng của từng loại phủ tạng trước khi xử lý mẫu. Ghi chính xác khối lượng từng loại phủ tạng đã lấy để phân tích, xét nghiệm trước khi xử lý mẫu làm cơ sở cho sự tính tốn sau này.
2. Quy trình xử lý mẫu phủ tạng động vật thí nghiệm nghiệm
Nếu số lượng mẫu phủ tạng động vật ít hơn 150g ta chia mẫu thành 02 phần:
- 01 phần để xác định chất độc bay hơi, bã cịn lại để vơ cơ hố tìm các chất độc vơ cơ.
- 01 phần để xác định các chất độc hữu cơ. Nếu số lượng mẫu phủ tạng lấy được rất ít (dưới 50g), phải lần lượt tiến hành xác định các chất độc bay hơi. Sau đĩ, phần bã được ngâm cồn cĩ thêm acid tactric để đạt tới pH=4-5, lọc, loại albumin, chiết xuất nhiều lần liên tiếp ở 2 mơi trường axit và kiềm để tìm chất độc hữu cơ. Phần bã và giấy lọc sau đĩ được vơ cơ hố để tìm chất độc vơ cơ.
Thơng thường, khi làm thí nghiệm thử độc tính trên động vật, người thực hiện đã biết rõ loại thuốc đĩ là gì. Như vậy, cĩ thể bỏ qua phần thử định tính. Cơng việc cịn lại chỉ là xác định lượng tồn dư của các chất độc đĩ trong các cơ quan nội tạng của động vật thí nghiệm. Do vậy, cần lấy riêng từng loại phủ tạng và xác định chất độc tồn dư trong loại phủ tạng đĩ.
Trong trường hợp đánh độc cùng một lúc nhiều loại chất độc khác nhau, phủ tạng được cắt và xay
nhỏ chia làm 3 phần nhằm mục đích: - Phân tích tìm chất độc bay hơi; - Phân tích tìm chất độc hữu cơ; - Phân tích tìm chất độc vơ cơ.
nhỏ chia làm 3 phần nhằm mục đích: - Phân tích tìm chất độc bay hơi; - Phân tích tìm chất độc hữu cơ; - Phân tích tìm chất độc vơ cơ.
3.1. Xác định các chất độc bay hơi
3.1.1. Chuẩn bị dụng cụ
Lắp bộ cất kéo theo hơi nước: Rửa sạch các ống dẫn hơi bằng hơi nước nĩng, chuẩn bị bình sinh hơi nước đã được đun sơi từ trước.
Chuẩn bị các bình hứng: 02 bình nĩn cĩ nắp mài, đánh số 1 & 2 dung tích 100ml cĩ chứa sẵn 5 ml nước cất đã được kiềm hố trước tới pH= 9 -10, bằng dung dịch NaOH hoặc KOH 30% và 01 bình hứng cĩ sẵn 10ml nước Brom bão hồ. Tất cả hai bình hứng khi tiến hành hứng dịch cất kéo bằng hơi nước phải đặt trong 01 bát sứ cĩ chứa đá để làm lạnh.
3.1.2. Chuẩn bị mẫu thử
Lấy khoảng 5 gam phủ tạng động vật thí nghiệm xay nhỏ bằng máy xay thịt, cho vào bình cất cĩ dung tích 250ml, thêm 25ml nước để tạo thành hỗn hợp đặc sệt, lắc đều. Thêm 5ml Acid sulfuric 10% lắc nhẹ và lắp ngay vào bộ cất kéo hơi nước đã chuẩn bị trước.
Làm nĩng đều bình đựng mẫu lên từ từ rồi tăng mạnh nhiệt độ bình sinh hơi để cho hơi nước sục mạnh vào bình đựng mẫu phủ tạng.
3.1.3. Xác định chất độc bay hơi
- Hứng trực tiếp vào bình hứng số 1 từ 15-20 ml dịch cất đầu tiên để sơ bộ tìm cyanua, các hợp chất Clo hữu cơ.
- Trong quá trình cất, nếu thấy dịch hứng trong kiềm ở bình hứng cĩ màu vàng chanh thì đĩ cĩ thể là các thuốc bảo vệ thực cĩ gốc paranitrophenol (wofatox, parathion).
- Các phản ứng tìm Clo hữu cơ sau khi thuỷ phân bằng HNO3 và tìm Cl- bằng AgNO3 để xác định các thuốc BVTV như DDT, 666, cypermethrin....
- Muốn tìm các loại chất độc cĩ kẽm thì hứng dịch cất bay hơi vào bình nĩn thứ 2 đã chuẩn bị cĩ sẵn 10ml dung dịch nước brom bão hồ. Hứng cho tới khi dịch cất nhỏ xuống, khơng làm mất màu vàng của nước brom bão hồ tức là lúc kết thúc quá trình cất. Lấy dịch cất được cơ trên bát sứ để giảm thể tích và đuổi hết brom thừa (hết màu vàng). Sau đĩ, tiến hành tìm phosphat bằng thuốc thử nitromolipdic và định lượng chúng bằng phương pháp đã quy định.
3.2. Xác định các chất độc hữu cơ
Phủ tạng động vật được xay nhỏ, ngâm bằng cồn ethanol. Thêm dung dịch axit tactric 30% trong ethanol tới khi pH=4-5 trong 1 bình nĩn, nắp mài miệng rộng, cĩ dung tích khoảng 250ml. Đậy kín, để khoảng 24 giờ. Lọc bằng giấy lọc gấp nếp, lấy dịch lọc, cơ trên cách thuỷ tới dạng sền sệt như sirơ, để nguội. Loại albumin bằng cách dùng đũa thuỷ tinh khuấy nhẹ, vừa khuấy vừa cho thêm cồn ethanol 96° tới khi khơng cịn thấy tủa anbumin màu trắng đục xuất hiện. Lọc qua giấy lọc gấp nếp, lấy dịch lọc và tiếp tục loại anbumin như trên 1 hoặc 2 lần nữa đến khi nhỏ 1 giọt cồn ethanol vào dịch cơ đặc khơng thấy tủa màu trắng xuất hiện là việc loại anbumin đã hồn thành. Dịch cơ đặc trên được hịa vào 40-50 ml nước cất, lọc qua giấy lọc, dung dịch nước lọc ở pH = 4-5 trên được chiết xuất bằng 20ml ether dầu hoả 1-2 lần để loại mỡ và các tạp chất tương tự ra khỏi dịch lọc. Bỏ phần ether dầu hoả phía trên, lớp nước được chiết xuất nhiều lần liên tiếp ở mơi trường axit (pH =4-5) và mơi trường kiềm (pH =9-10) bằng ether hoặc cloroform.
Loại dung mơi bằng cách cơ chân khơng, sẽ thu được cặn khơ chiết ở 2 mơi trường axit và kiềm. Hịa tan cặn này trong dung mơi thích hợp để xác định các chất độc hữu cơ bằng các phương pháp như GC, HPLC, quang phổ.
3.3. Phương pháp phân tích các chất độc vơ cơ
3.3.1. Phương pháp vơ cơ hĩa ướt trong bình keldan
Phủ tạng động vật được xay nhỏ, cho vào bình
kendal cĩ dung tích thích hợp, thêm 25ml nước cất, khuấy đều, thêm từ từ 25 ml axit sunfuric đặc (d=1,98), vừa cho vừa khuấy nhẹ. Đặt mẫu thử lên đèn gaz (đun cách lưới amian), đốt từ từ cho mẫu thử tan nhuyễn hết, vừa đốt vừa cho từng giọt acid nitric 50% đến khi mẫu thử cĩ màu vàng (chú ý khơng để mẫu phủ tạng bị cháy đen). Ngừng đốt, để nguội, lọc (gạn) bỏ lớp mỡ bên trên, lấy dịch trong (5ml) xác định sơ bộ thuỷ ngân. Nếu cĩ thuỷ ngân, dùng 1/2 lương mẫu thử để định lượng thuỷ ngân. Lượng mẫu thử cịn lại tiếp tục tăng nhiệt độ đốt mạnh. Nếu thấy mẫu thử cĩ màu vàng nâu hoặc đen thì phải cho từ từ ít một dung dịch axit nitric 50% hoặc nước oxy già 30% thể tích đến khi mẫu thử cĩ màu trắng và cĩ khĩi trắng bốc lên là quá trình vơ cơ hố hồn thành. Dịch vơ cơ hố này dùng để phân tích các độc chất cĩ chứa kẽm, asenic, chì, vv…
Trong quá trình vơ cơ hĩa, cĩ thể nhận xét sơ bộ: - Nếu cĩ tủa màu trắng lắng xuống bình keldal thì cĩ thể là tủa PbSO4
- Nếu dịch vơ cơ cĩ màu xanh thì cĩ thể cĩ muối crom III hoặc CuSO4, vv...
3.3.2. Phương pháp vơ cơ hố khơ bằng natri kimloại
Phương pháp này được áp dụng để vơ cơ hố trong trường hợp lượng phủ tạng động vật thí nghiệm ít hoặc rất ít. Lấy một lượng phủ tạng cho vào một ống nghiệm. Thêm 0,5g Canci cacbonat và 0,1g natri kimloại và đốt ống nghiệm trên ngọn lửa đèn gaz, cho tới khi nĩng đỏ đáy ống nghiệm. Nhúng ngay đáy ống nghiệm vào 10ml nước cất đã chuẩn bị sẵn trong 1 cốc thuỷ tinh cĩ mỏ. Rửa mảnh vỡ của ống nghiệm bằng nước cất và gộp dịch rửa với dịch trong cốc thuỷ tinh cĩ mỏ, lọc qua giấy lọc gấp nếp đã thấm ướt bằng nước cất. Điều chỉnh thể tích của dịch lọc tới thể tích cần thiết (bằng cách cơ) và điều chỉnh đến pH thích hợp để tìm các nguyên tố: S, P, Cl, vv...bằng các phương pháp thích hợp.