Vitamin K là một nhĩm các vitamin hịa tan trong chất béo, giống nhau về cấu trúc cĩ một vai trị quan trọng trong sự điều chỉnh sự đơng đặc của máu, do đĩ rất cần thiết cho hỗ trợ sự đơng máu. Vitamin K cịn hỗ trợ sự trao đổi chất của xương và trao đổi chất của canxi trong hệ thống mạch máu. Tại “Hội nghị khoa học kiểm nghiệm thực phẩm 2018” diễn ra mới đây, tại Hà Nội, ThS. Vũ Thị Trang, Phịng thí nghiệm Viện kiểm nghiệm An tồn thực phẩm quốc gia đã giới thiệu phương pháp cĩ thể xác định đồng thời cả vitamin K1 và vitamin K2 trong thực phẩm chức năng, Tạp chí Thử nghiệm Ngày nay xin thơng tin đến bạn đọc kết quả nghiên cứu này .
Vitamin K cĩ 2 dạng tự nhiên: Vitamin K1 hay cịn gọi là phylloquinone, được tìm thấy trong thức ăn tự nhiên. Vitamin K2 hay cịn gọi là menaquinone, được tạo ra bởi các loại vi khuẩn cĩ ích ở trong ruột.
Cĩ 3 dạng vitamin K tổng hợp được biết đến, đĩ là các vitamin K3, K4, và K5. Dù vitamin K1 và K2 tự nhiên là khơng độc, nhưng từ dạng tổng hợp K3 (menadione) trở đi chỉ phù hợp sử dụng trên động vật và cĩ độc với con người. Hiện tại, chỉ cĩ một số vitamin K3 được sử dụng để bổ sung vào thức ăn chăn nuơi.
Bổ sung vitamin K vào thực phẩm cĩ tác dụng hỗ trợ quá trình đơng máu, phát triển xương, bảo
vệ chống lại xơ vữa động mạch và một số bệnh lý tim mạch nên rất cần thiết cho mọi lứa tuổi, đặc biệt quan trọng đối với trẻ sơ sinh trong những tháng đầu. Do đĩ cĩ nhiều sản phẩm dành cho người già hay trẻ nhỏ được bổ sung vitamin K.
Vitamin K cĩ nhiều trong các loại rau xanh (cải, bơng cải,…), dầu thực vật (dầu đậu nành), trái cây (bơ, kiwi, nho,…). Tuy nhiên, chỉ cĩ 5-10% lượng vitamin K1 được hấp thu ở đường tiêu hố từ nguồn thực phẩm. Do đĩ, chúng ta cĩ thể bổ sung các loại vitamin K từ các nguồn khác: sữa, thực phẩm dinh dưỡng cơng thức, thực phẩm bổ sung… Đây là những sản phẩm bổ sung vitamin K ổn định.
Trên thế giới hiện nay, chưa cĩ nhiều nghiên cứu và cơng bố về phương pháp xác định vitamin K. Phương pháp hiện đại nhất hiện nay là AOAC 2015.09, sử dụng HPLC pha thường, khử sau cột, phát hiện huỳnh quang. Để nâng cao chất lượng phương pháp thử, tháng 9/2018, AOAC đã thơng báo cập nhật thêm yêu cầu thử nghiệm liên phịng đối của phương pháp này để xác định vitamin K1 trong thực phẩm dinh dưỡng cơng thức, thực phẩm dinh dưỡng y học.
AOAC 2015.09 dựa trên nguyên tắc vitamin K1 được tách bằng sắc ký pha thường, khử sau cột và phát hiện huỳnh quang. Tuy nhiên, vitamin K khơng cĩ khả năng phát huỳnh quang nên phải dùng tác nhân khử sau khi tách để cĩ thể phát huỳnh quang và phát hiện bằng detector huỳnh quang.
Cùng với một số phương pháp xác định vitamin K bằng phương pháp HPLC, gần đây đã cĩ một số cơng bố về sử dụng phương pháp LC-MS/MS để xác định vitamin K1 trong sữa, thực phẩm cơng thức cho trẻ nhỏ, tuy nhiên, các phương pháp (cả cũ và mới) hầu như chỉ dừng lại ở xác định vitamin K1.
Để cĩ thể xác định đồng thời vitamin K1,
vitamin K2 trong thực phẩm, thực phẩm chức năng bằng LC-MS/MS, ThS. Vũ Thị Trang đã nghiên cứu các điều kiện tối ưu để xác định vitamin K1, vitamin
K2 bằng LCMS/MS; Nghiên cứu điều kiện xử lý mẫu tối ưu để tách chiết vitamin K1, vitamin K2; Thẩm định phương pháp; Xác định hàm lượng vitamin K1, vitamin K2 trong một số mẫu thực: sữa và sản phẩm thực phẩm chức năng.
Để thực hiện, ThS Vũ Thị Trang đã tối ưu tự động điều kiện LC - MS/MS Xevo TQD của Waters trong phịng thí nghiệm, sử dụng cột C18 BEH (50mm × 2,1mm × 1,7μm); Pha động: 100% methanol, tốc độ dịng 0,2 ml/phút; Điều kiện LC cĩ ion hĩa để tiến hành khảo sát cột tách, pha động để tách vitamin K1 và K2 với 2 dạng chủ yếu là MK-4 và MK-7 thường được sử dụng trong sữa và thực phẩm chức năng.
Phương pháp xử lý mẫu truyền thống hiện nay để phân tích vitamin K trong dầu là tiến hành xà phịng hĩa trong mơi trường KOH và methanol. Tuy nhiên, sử dụng phương pháp này mất rất nhiều thời gian (cĩ nền mẫu phải mất từ 15 đến 24 giờ vì phải thực hiện xà phịng hĩa qua đêm).
Để khắc phục nhược điểm này, việc sử dụng phương pháp thủy phân chất béo sử dụng enzym lipase sẽ rút ngắn được thời gian (với nền mẫu rắn sẽ được bổ sung thêm nước để đồng nhất và tạo
mơi trường đệm pH từ 7,9 đến 8; hỗ trợ thủy phân bằng enzym lipase). Sau khi thủy phân xong, mẫu sẽ được chiết bằng dung mơi hữu cơ hịa tan được vitamin K, sau đĩ, cơ quay bởi dung mơi hữu cơ... và phân tích bằng LC-MS/MS.
Thời gian thủy phân được thực hiện trong khoảng thời gian từ 30 đến 150 phút và kết quả thu được ở 120 phút, cho hàm lượng vitamin K lớn nhất và được thể hiện ở lượng vitamin K1 và MK-7.
Nhiệt độ thủy phân được lựa chọn từ 30 đến 500C. Tại 370C (± 20C), cho hiệu suất thủy phân cao nhất. Đây cũng là nhiệt độ lý tưởng để enzym lipase hoạt động.
Về dung mơi chiết, qua tiến hành thử trên các loại dung mơi n-hexan, diethyl etther, petrolium, dichlomethan cĩ khả năng chiết gần như tương đồng nhau, nhưng n-hexan cho khả năng chiết vitamin K1 và K2 tốt nhất.
Việc sử dụng khối phổ được tham khảo và thực hiện theo quy định 2002/657/EC để phân tích mẫu trắng (hình A), mẫu chuẩn (hình B) và mẫu phân tích (hình C). Kết quả cho thấy, độ đặc hiệu rất cao khi sử dụng khối phổ hai lần.
Cùng với thẩm định độ đặc hiệu, độ chọn lọc, các thơng số về đường chuẩn, giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng, độ lặp lại, độ thu hồi cũng cho kết quả: Đường chuẩn của Vitamin K1 tuyến tính trong khoảng 0,01 – 9 ng/ml và cĩ thể mở rộng hơn, của Vitamin K2 tuyến tính trong khoảng 0,02 – 4 ng/ml;… So sánh các thơng số này đều phù hợp và đáp ứng
yêu cầu của AOAC.
Sau khi tối ưu phương pháp, tiến hành áp dụng trên một số nền mẫu thực gồm 3 mẫu sữa và 3 mẫu thực phẩm chức năng cho thấy, hàm lượng Vitamin K1, K2 trong sữa và thực phẩm chức năng sẽ tùy thuộc mục đích hỗ trợ cơ thể mà nhà sản xuất bổ sung hàm lượng khác nhau.
ThS. Vũ Thị Trang nhận xét, LC-MS/MS cĩ nhiều ưu điểm hơn so với các phương pháp trước đây: Thay vì phải cĩ thêm bước khử sau cột khi sử dụng HPLC thì phương pháp LC MS/MS cĩ độ phát hiện nhạy và chính xác hơn; Tách sắc ký LC pha đảo chỉ cần sử dụng 100% methanol, tốc độ dịng 0,2
mL/phút trong khi HPLC pha thường cĩ nhiều diểm khơng thuận tiện, độ rửa giải chậm; LC-MS/MS phân tích được đồng thời được cả Vitamin K1, MK-4 và MK-7 trong khi HPLC chỉ áp dụng cho phân tích vitamin K1 và cĩ sự ảnh hưởng của vitamin K2.
MINH QUÂN lược ghi