V. YÊU CẦU CỦA MỘT VACXIN
2.2. Phương pháp kiểm nghiệm
2.2.1. Lấy mẫu và bảo quản mẫu
Mẫu kiểm nghiệm là các ựơn vị sản phẩm ựược lấy ra từ các lô vacxin ựể tiến hành kiểm nghiệm trước khi xuất ra sử dụng và lưu giữ trong thời gian bảo quản của vacxin ựể giải quyết các tranh chấp nếu có.
Mẫu phải có tắnh ựại diện, lấy ngẫu nhiên tỷ lệ quy ựịnh và ựược bảo quản trong ựiều kiện phù hợp và an toàn, khi ựến phòng kiểm nghiệm phải ựược tiến hành ngay các thủ tục kiểm nghiệm trong thời gian ngắn nhất.
Các nhà sản xuất cũng nên giữ mẫu này trong vòng 6 tháng sau khi hết hạn sử dụng ghi trên nhãn vì chúng có thể giúp ựánh giá những vấn ựề xảy ra trong quy trình sử dụng vacxin.
Lấy mẫu:
Mẫu ựược lấy theo lô vacxin. Lô vacxin là toàn bộ các sản phẩm ựược chia vào vật chứa cuối cùng từ cùng một khối lượng vacxin ựồng nhất, trong cùng một ca sản xuất. Mẫu ựược lấy theo tỷ lệ sau:
- 10% sản phẩm (ắt nhất là 5) ựối với lô dưới 100 sản phẩm. - 10% sản phẩm với lô từ 100 ựến dưới 500 sản phẩm.
- 2% sản phẩm ựối với lô từ 500 sản phẩm trở lên (nhiều nhất là 20 sản phẩm).
Mẫu lấy xong phải ựược bao gói, dán nhãn và bảo quản ở ựiều kiện bảo quản của vacxin.
Nhãn phải ghi rõ: - Nơi sản xuất - Tên sản phẩm
- Số lôẦ, ngày Ầtháng Ầ năm Ầ sản xuất - Số lượng và ựặc ựiểm sản phẩm
- Người lấy mẫu - Thời gian lấy mẫu - điều kiện bảo quản.
Sử dụng mẫu: mẫu ựược chia làm 3 nhóm như sau:
- Nhóm 1: từ 3 sản phẩm trở lên, dùng ựể kiểm tra thuần khiết. - Nhóm 2: từ 3 sản phẩm trở lên dùng ựể kiểm tra các chỉ tiêu khác. - Nhóm 3: 2 sản phẩm ựể lưu giữ.
Trong trường hợp mẫu có số lượng tối thiểu (5 sản phẩm) thì nhóm 1 và 2 gộp làm một.
2.2.2. Các phương pháp kiểm nghiệm
Mỗi loại vacxin có một quy trình kiểm nghiệm ựược chấp nhận bởi cơ quan có thẩm quyền quốc giạ Nội dung kiểm nghiệm chung bao gồm:
. Kiểm tra ựộ thuần khiết
độ thuần khiết của vacxin ựược xác ựịnh bằng các kiểm tra việc nhiễm tạp khuẩn. Các xét nghiệm xác ựịnh sự nhiễm khuẩn ựược tiến hành trên giống gốc, giống sản xuất, môi trường tế bào nguyên thủy, các thành phần có nguồn gốc ựộng vật như huyết thanh bê và mỗi lô sản phẩm trước khi mang ra sử dụng.
Các phương pháp sử dụng ựể ựảm bảo ựộ tinh sạch của sản phẩm thay ựổi tùy theo bản chất của sản phẩm, ựược mô tả chi tiết trong quy trình kiểm nghiệm hoặc trong quy trình sản xuất của từng loại vacxin (tiêu chuẩn kiểm nghiệm cơ sở).
* để xác ựịnh vi sinh vật ngoại lai là vi khuẩn, Mycoplasma và nấm, người ta cấy mẫu vào các môi trường nuôi cấy thắch hợp, nuôi cấy ở nhiệt ựộ tối ưu trong vòng 14 giờ rồi ựọc kết quả.
* Môi trường sử dụng:
Môi trường phát hiện vi khuẩn gồm: Môi trường nước thịt pepton Môi trường nước thịt gan yếm khắ Môi trường thạch máu
Môi trường thạch thường
Môi trường ựặc biệt (tùy yêu cầu).
Môi trường phát hiện nấm: Sabouraud
SCD (Soybeancasein digest)
Với môi trường lỏng ựược ựựng trong ống φ16, mỗi ống chứa 15ml môi trường.
Tiến hành:
Mẫu thử
Loại môi trường
Số lượng môi trường Số lượng mẫu cấy Nhiệt ựộ nuôi Thời gian theo dõi (ngày) Huyết thanh Nước thịt Thạch máu
Nước thịt gan yếm khắ SCD 4 ống 4 ống 4 ống 4 ống 1ml/ống 370C 370C 370C 20 - 250C 14 ngày Giống gốc (virus) Nước thịt Thạch máu
Nước thịt gan yếm khắ SCD 4 ống 4 ống 4 ống 4 ống 1ml/ống 370C 370C 370C 20 - 250C 14 ngày Hỗn dịch tế bào Nước thịt Thạch máu
Nước thịt gan yếm khắ SCD 4 ống 4 ống 4 ống 4 ống 1ml/ống 370C 370C 370C 20 - 250C 14 ngày Vacxin bán thành phẩm Nước thịt Thạch máu
Nước thịt gan yếm khắ SCD 4 ống 4 ống 4 ống 4 ống 1ml/ống 370C 370C 370C 20 - 250C 14 ngày Vacxin thành phẩm Nước thịt Thạch máu
Nước thịt gan yếm khắ SCD 4 ống 4 ống 4 ống 4 ống 1ml/ống 370C 370C 370C 20 - 250C 14 ngày * đánh giá kết quả:
- đến cuối quá trình theo dõi mà tất cả các ống thử ựều trong suốt, mầu sắc môi trường không ựổi, kết quả là âm tắnh.
- Nếu có một trong các ống thử có biểu hiện nhiễm trùng thì phải tiến hành nhuộm và soi kắnh ựể xác ựịnh loại vi khuẩn, ựồng thời kiểm tra lại lần 2 với số mẫu như trên. Nếu lần 2 âm tắnh thì mẫu ựược coi là âm tắnh.
- Nếu lần 2 cũng dương tắnh và cùng loại tạp khuẩn như lần 1 thì mẫu ựó ựược coi là dương tắnh. Loạt vacxin hay lô có mẫu kiểm tra phải loại bỏ.
với cách thức như trên.
* Xác ựịnh virus ngoại lai: Tùy theo yêu cầu kiểm tra loại virus ngoại lai, dựa vào ựặc tắnh của virus mà lựa chọn những phương pháp thắch hợp.
Vắ dụ: Với virus gây ngưng kết hồng cầu có thể kiểm tra bằng phản ứng HẠ
Virus gây bệnh Leucosis, viêm màng não, SV40... có thể sử dụng PCR, các phản ứng huyết thanh học như ELISA, miễn dịch huỳnh quang, thậm chắ có thể gây nhiễm trên tế bào hoặc qua phôi trứng.
Những biện pháp trên cũng có thể áp dụng ựể kiểm tra các loại vacxin vô hoạt ở góc ựộ: quá trình vô hoạt ựã triệt ựể hay chưạ
. Kiểm tra ựộ an toàn
An toàn là chỉ tiêu quan trọng của một loại vacxin. Một vacxin khi sử dụng phòng bệnh cho ựộng vật phải ựạt ựược chỉ tiêu nàỵ
độ an toàn thực chất của một vacxin phải ựược chứng minh sớm trong giai ựoạn hình thành sản phẩm và sau khi sản xuất.
Xác ựịnh chỉ tiêu an toàn phải ựược tiến hành qua nhiều bước thử trong phòng thắ nghiệm, trên thực ựịa, ở quy mô nhỏ và ựại trà.
* Kiểm tra khả năng tăng ựộc lực: Yêu cầu này ựược thực hiện với các loại vacxin sống. Khi sử dụng vacxin sống tiêm cho vật chủ, các vi sinh vật có thể từ ựó lây lan sang những ựộng vật tiếp xúc với nó và có thể gây thành bệnh nếu như vi sinh vật vẫn còn ựộc lực hoặc trở nên có ựộc lực trở lạị Do vậy, tất cả các loại vacxin nhược ựộc cần phải kiểm tra ựộc lực bằng phương pháp tiêm truyền. Vi sinh vật trong vacxin ựược cấy chuyển in vivo bằng cách gây nhiễm vacxin cho một nhóm ựộng vật cảm thụ với giống gốc luôn dùng ựường mắc bệnh tự nhiêm với loài ựộng vật ựó. Sau ựó, vi sinh vật vacxin ựược thu nhận lại từ mô bào hay chất bài tiết của ựộng vật ựã gây nhiễm trên ựược dùng ựể gây nhiễm cho nhóm ựộng vật khác. Sau không ắt hơn 5 lần cấy chuyển như vậy, chủng vi sinh vật ựược phân lập lại và ựược kiểm tra ựầy ựủ các ựặc tắnh sinh học và ựộc lực như phương pháp kiểm tra giống gốc.
Vi sinh vật vacxin phải có ựộc lực giảm và ổn ựịnh có thể chấp nhận ựược sau khi cấy chuyển theo cách nàỵ
* Kiểm tra nguy cơ với môi trường:
Vacxin sống có thể bài thải, làm lây lan cho ựộng vật mẫn cảm hoặc không mẫn cảm và gây hại cho môi trường. Vì thế cần tiến hành kiểm tra nguy cơ ô nhiễm vi sinh vật vacxin (nếu có) ựể khi sử dụng vacxin cần có những biện pháp khống chế.
Vắ dụ: Vacxin nhược ựộc nha bào nhiệt thán khi tiêm phải hạn chế rơi rớt ra bên ngoài, bơm tiêm và lọ vacxin dùng xong phải tiêu ựộc...
* Kiểm tra tắnh an toàn của vacxin trước khi sử dụng cho ựộng vật:
Các kiểm tra an toàn với một lô sản phẩm vacxin thường ựược tiến hành bằng cách tiêm cho ựộng vật thắ nghiệm (chuột nhắt, chuột lang, mèo, chó, lợn, gia cầm) hoặc cho bản ựộng vật tùy theo quy trình chỉ dẫn.
Việc kiểm tra này ựược thực hiện theo các bước:
- Trong phòng thắ nghiệm: Nguyên tắc chung, tất cả các loại vacxin ựều yêu cầu các thử nghiệm sử dụng quá liều: gấp 10 lần ựối với vacxin sống và gấp 2 lần với vacxin vô hoạt.
- Trong ựiều kiện không thực hiện ựược có thể nhận kết quả của các thắ nghiệm kiểm tra hiệu lực, khi dùng vật chủ ựể kiểm tra hiệu lực của vacxin trong phòng thắ nghiệm, ựộ an toàn có thể ựược xác ựịnh dựa vào các quan sát hàng ngày của ựộng vật sau khi ựược tiêm vacxin trong suốt giai ựoạn trước khi công cường ựộc.
Nội dung tiến hành:
Pha vacxin với liều ựã hướng dẫn trong quy trình kiểm nghiệm, tiêm cho ựộng vật thắ nghiệm với các lô ựã ựược bố trắ theo các liều thử khác nhau, sau ựó theo dõi một thời gian ựã ựược quy ựịnh.
Nội dung theo dõi gồm:
- Phản ứng toàn thân: sốt, kém ăn, bỏ ăn, sốc vacxin tức thì, các phản ứng phụ khác... - Phản ứng cục bộ: viêm, sưng.
Tắnh tỷ lệ phản ứng của mỗi nội dung theo dõi, ghi chép ựánh giá kết quả.
- Thử nghiệm lâm sàng: tất cả các vacxin dùng cho ựộng vật nên ựược kiểm tra an toàn, nếu có thể trên lâm sàng (thực tế sản xuất) trước khi ựược cấp giấy chứng nhận cho phép sử dụng chắnh thức.
Trong ựiều kiện thực tế, vừa xác ựịnh các phản ứng không mong muốn bao gồm cả tỷ lệ chết mà những vấn ựề này không thể quan sát ựược trong quá trình sản xuất. Các thắ nghiệm ựược thực hiện trên bản ựộng vật, ở các vùng ựịa lý khác nhau và với một số lượng lớn ựộng vật mẫn cảm. động vật thắ nghiệm cần ựại diện cho mọi lứa tuổi, loại hình chăn nuôị Thắ nghiệm cần ựược tiến hành với nhiều lô vacxin trong các mẻ sản xuất.
Phương pháp tiến hành là sử dụng vacxin theo liều lượng chỉ dẫn và theo dõi các phản ứng nếu có.
Hoàn thiện quy trình về phương pháp quan sát và ghi chép thắ nghiệm. Vacxin ựược coi là an toàn khi không có hoặc có ắt các phản ứng sau khi sử dụng. Các phản ứng này ở trong mức ựộ cho phép.
. Kiểm tra hiệu lực
Kiểm tra hiệu lực của vacxin là yêu cầu cần thiết ựối với mỗi lô sản xuất.
Có nhiều phương pháp kiểm tra, nhưng hiệu lực của vacxin dùng trong thú y nên ựược chứng minh bằng phương pháp công cường ựộc trên bản ựộng vật, với những con ở lứa tuổi mẫn cảm nhất, thực hiện dưới những ựiều kiện tiêu chuẩn và trên những ựộng vật có huyết thanh âm tắnh.
Trong trường hợp có các phương pháp thử khác thay thế có giá trị tin tưởng, người ta sẽ hạn chế sử dụng phương pháp công cường ựộc. Vì vậy, việc áp dụng các nguyên lý thay thế, giảm hoặc chọn lọc các kiểm tra trên ựộng vật (nguyên lý 3R - Replace, Reduce và Refine animal test) ựược khuyến khắch sử dụng nếu có thể ựược.
Phương pháp công cường ựộc
để thực hiện phương pháp này, người ta cần phải có giống vi sinh vật cường ựộc tiêu chuẩn có các chỉ số sinh học ổn ựịnh, ựặc biệt là chỉ số LD50 với bản ựộng vật và ựộng vật thắ nghiệm thay thế.
Tiến hành gây miễn dịch cho nhóm ựộng vật thắ nghiệm bằng liều vacxin sử dụng khi có miễn dịch chắc chắn (khoảng 2 - 3 tuần) tiến hành gây nhiễm giống cường ựộc tiêu chuẩn với liều chắ tử (thường là 100 LD50 - 1.000 LD50), có bố trắ lô ựộng vật ựối chứng không ựược tiêm vacxin.
Tiêu chuẩn của ựộng vật thắ nghiệm trong thử thách cường ựộc là khoẻ mạnh, có phản ứng huyết thanh âm tắnh với loại vi sinh vật có trong vacxin ựem thử.
Theo dõi những biểu hiện lâm sàng và tỷ lệ chết của cả 2 lô thắ nghiệm và ựối chứng. Thắ nghiệm ựạt ựược khi ở lô ựối chứng ựộng vật mang thử chết 100% với triệu chứng và bệnh tắch ựiển hình của bệnh. Tắnh tỷ lệ phần trăm sống sót ở lô thắ nghiệm, tỷ lệ này phải ựạt ắt nhất 80% thì lô vacxin mới ựạt ựược chỉ tiêu hiệu lực. Dĩ nhiên, tỷ lệ này càng cao càng
tốt.
Cũng có thể tiến hành thắ nghiệm trên thực ựịa bằng cách tiêm vacxin với liều sử dụng cho một quần thể ựộng vật ngoài thực ựịa, sau một thời gian khi miễn dịch ựược thành lập chắc chắn, bắt ngẫu nhiên một lượng cá thể ựủ lớn rồi tiến hành thử thách cường ựộc, xác ựịnh tỷ lệ bảo hộ.
Cần chú ý rằng: việc tiến hành công cường ựộc phải ựược thực hiện trong phòng thắ nghiệm chuyên biệt ựể kiểm nghiệm vacxin ựộng vật, phải ựảm bảo ựộ an toàn sinh học tuyệt ựối, có nghĩa là khi tiến hành công cường ựộc, các vi sinh vật cường ựộc không ựược gây ô nhiễm ra môi trường bên ngoàị
Các phương pháp thử hiệu lực thay thế
. Phương pháp thử hiệu lực lâm sàng
Phương pháp này có thể sử dụng ựể thiết lập hiệu lực khi các nghiên cứu công cường ựộc không thể thực hiện ựược.
Người ta sử dụng vacxin cho một quần thể ựộng vật trên thực ựịa, ựan xen với các quần thể ựộng vật khác không ựược sử dụng vacxin và trong vùng ựịa lý ựang có dịch lưu hành. Theo dõi khả năng miễn dịch ở quần thể ựã sử dụng vacxin.
Tuy nhiên, khó có thể nhận ựược các thông số rõ ràng ựể chứng minh hiệu lực vacxin trong trường hợp này bởi vì quy trình thử nghiệm lâm sàng rất phức tạp, dù cho có một thiết kế thắ nghiệm phù hợp nhưng cũng khó kết luận do các ảnh hưởng phụ không mong muốn như: khả năng chống chịu của các cá thể khác nhau rất lớn, khả năng mắc bệnh thấp ở ựàn không sử dụng vacxin hoặc có những nguyên nhân khác cũng gây ra bệnh tương tự.
Do ựó, ở một số loại vacxin, yêu cầu xác ựịnh hiệu lực bằng cả hai phương pháp: thử nghiệm hiệu lực trong phòng thắ nghiệm và thử nghiệm lâm sàng.
. định lượng kháng nguyên
Với một số loại vacxin, việc ựánh giá hiệu lực có thể ựược thực hiện bằng phương pháp ựịnh lượng kháng nguyên.
Với vacxin vi khuẩn, tiến hành ựếm số lượng vi khuẩn. Số lượng vi khuẩn ựếm ựược trong 1 ựơn vị dung tắch của vacxin (ml) phải ựủ lớn ựể có thể gây miễn dịch bảo hộ và trong bất cứ khoảng thời gian nào trước khi hết hạn sử dụng thì số lượng vi khuẩn ựếm ựược phải bằng hoặc lớn hơn số lượng vi khuẩn tối thiểu ựủ khả năng gây miễn dịch.
Vắ dụ: trong vacxin tụ huyết trùng lợn vô hoạt, 1ml vacxin có chứa ắt nhất 1010 tế bào vi khuẩn.
Vacxin phó thương hàn lợn vô hoạt có 10 tỷ vi khuẩn/ml.
Vacxin phó thương hàn lợn nhược ựộc có 2 - 2,5 tỷ vi khuẩn/ 1 liều dùng. Vacxin nhược ựộc nha bào nhiệt thán có 30 triệu nha bào/ml...
Với các vacxin virus, người ta tiến hành ựịnh lượng theo phương pháp in vitrọ Vắ dụ: Với các virus nhược ựộc có khả năng ngưng kết hồng cầu, người ta xác ựịnh ựậm ựộ virus trong vacxin thông qua hiệu giá của phản ứng HẠ
Vacxin Newcastle hệ II chủng lasota, hiệu giá HA tối thiểu phải ựạt 1/64 (6log2), còn vacxin hệ I, hiệu giá này là 1/32 (5log2).
. định lượng kháng thể trong huyết thanh
Tiêm vacxin cho ựộng vật thắ nghiệm, tại thời ựiểm có miễn dịch chắc chắn, tiến hành lấy mẫu huyết thanh ựể ựịnh lượng kháng thể. Thông qua chỉ số trung hoà (NI) hoặc hiệu giá của phản ứng HI (với virus gây ngưng kết hồng cầu) ựể ựánh giá hiệu lực của vacxin.