V. YÊU CẦU CỦA MỘT VACXIN
2.2. Quy trình sản xuất vacxin virus
2.2.1.Vacxin nhược ựộc chế trên phôi trứng
Giống gốc
Ra chai dán nhãn bảo quản 2 -100C/2 năm Kiểm nghiệm vacxin
Gây nhiễm phôi trứng
Ra chai đông khô dán nhãn bảo quản Pha với nước sinh lý nồng ựộ 10-1 hoặc xELD50)
Gây giống sản xuất Kiểm tra vô trùng
Ấp tiếp ở 370C/x giờ
Thu trứng, ựể lạnh 40C/12h
Mổ trứng
Thu chất chứa virus
Bán thành phẩm Kiểm tra vô trùng
Nuôi cấy tế bào Gây nhiễm virus Trước khi giống virus thành thục Gặt tế bào
Thành thục giải phóng virus
Trước khi giống virus giải phóng Thu gom các hợp phần KN virus Tách các hợp phần KN virus Trộn Bổ trợ dầu Tập trung kháng nguyên virus
2.2.2. Quy trình sản xuất vacxin virus bằng công nghệ lựa chọn kháng nguyên
đối với vacxin virus còn có công nghệ sản xuất lựa chọn kháng nguyên. Nguyên lý của công nghệ này dựa theo nguyên lý sản xuất vacxin PRRS như sau:
để phòng bệnh ựặc hiệu, các nhà khoa học ựã tiến hành sản xuất vacxin PRRS dựa trên việc nghiên cứu công nghệ lựa chọn kháng nguyên ỎMJPRRSỎ . Nguyên lý sản xuất này ựòi hỏi phải thu hoạch vacxin trước khi virus thành thục và giải phóng ra khỏi tế bào nuôi cấỵ Việc làm này sẽ tối ựa hoá ựược lượng kháng nguyên trong sản phẩm.
Hình 2.1: Quy trình sản xuất vacxin phòng PRRS theo công nghệ lựa chọn kháng nguyên ỎMJPRRSỎ.
Khi thu hoạch ựược tế bào chứa các hạt virus, người ta tiến hành tách các hợp phần kháng nguyên, thu gom lại và gia thêm bổ trợ ựể ựược vacxin thành phẩm. Công nghệ
ỎMJPRRSỎ tương tự một quy trình sản xuất vacxin dưới ựơn vị. Việc triết tách các hợp phần kháng nguyên từ tế bào nuôi cấy có một vài bước ựặc biệt so với quy trình sản xuất vacxin thông thường ựể gần như loại bỏ hết các tế bào nuôi cấy trong sản phẩm cuối cùng và như vậy, có một thành phẩm vacxin ựạt ựộ tinh khiết kháng nguyên rất cao - ựó là vacxin phòng PRRS trong tương laị
2.2.3.Quy trình chế vacxin nhược ựộc Dịch tả lợn qua thỏ
Quy trình chế vacxin dịch tả lợn qua thỏ gồm các bước: Ờ Chuẩn bị
Ờ Tiếp giống và theo dõi Ờ Mổ thỏ kiểm tra bệnh tắch Ờ Chế vacxin
Chuẩn bị thỏ :
Thỏ ựược ựưa về trước 10 ngày, nhốt riêng, chăm sóc, nuôi dưỡng chu ựáọ Thỏ phải ựạt ựược các yêu cầu là: khỏe mạnh, không mắc bệnh truyền nhiễm, ký sinh trùng (ựặc biệt bệnh cầu trùng); khối lượng thỏ > 1,8 kg.
Ba ngày trước khi tiếp giống tiến hành ựo thân nhiệt thỏ, ngày 2 lần (sáng và chiều) vào những giờ nhất ựịnh, yêu cầu nhiệt ựộ trung bình các ngày không vượt quá 39,5ồC.
Số lượng thỏ chuẩn bị căn cứ vào lượng vacxin cần phải chế trong 1 ựợt. Với thỏ nặng 1,8 - 2 kg cho 18 - 20g hạch, lách. Khi pha vacxin nghiền hạch, lách theo tỷ lệ 1/200.
Số lượng thỏ chuẩn bị cần phải dư vì trong quá trình nuôi và theo dõi có những thỏ không ựạt tiêu chuẩn
Dụng cụ:
Ờ Bơm tiêm, kim tiêm ựể tiếp giống
Ờ Dao, kéo, bông cồn, vải gạc, cốc ựong, cối chày sứ
Ờ Tùy theo tắnh chất từng loại dụng cụ, tiến hành tiêu ựộc bằng cách sấy khô hoặc hấp ướt.
Giống virus vacxin
Ờ Có thể là giống ựông khô hoặc hạch, lách tươi
Phòng chế
Ờ đảm bảo vệ sinh, ựiều kiện vô trùng
Bước 2: Tiếp giống và theo dõi
Tiếp giống
Ờ Nếu là giống ựông khô, hòa với nước sinh lý theo hướng dẫn
Ờ Nếu là hạch, lách nguyên thì cắt bỏ bạc nhạc, màng mỡ bên ngoài, cân lên và nghiền với nước sinh lý theo tỷ lệ 1/20, lọc, xử lý kháng sinh
Ờ Tiêm 1ml vào tĩnh mạch dìa tai thỏ
Theo dõi thỏ
Ờ Thỏ ựược tiếp giống dịch tả lợn sau khi tiêm cứ 6 giờ theo dõi nhiệt ựộ 1 lần (không kể ngày ựêm)
Ờ Sau 1 - 2 ngày thỏ bắt ựầu sốt, sốt cao hơn bình thường 1 - 2ồC Ờ Mổ thỏ ựể lấy hạch màng treo ruột và lá lách ựể chế vacxin
Ờ Không lấy hạch và lách của những thỏ sốt lên xuống thất thường và thỏ sốt dưới 0,5ồC.
Bước 3 : Mổ thỏ kiểm tra bệnh tắch
Nếu thỏ phản ứng nhiệt ựộ ựúng tiêu chuẩn, thường giết thỏ trong khoảng 59 - 62 giờ tắnh từ khi tiếp giống.
Kiểm tra bệnh tắch: Thỏ tiếp giống dịch tả lợn hầu như không có bệnh tắch, nếu có chỉ là sưng hạch lâm ba và lá lách.
Bước 4: Chế vacxin
Toàn bộ hạch và lách của thỏ ựạt tiêu chuẩn ựược tập trung ựể chế thành 1 lô vacxin, ựược xử lý:
- Nghiền với nước sinh lý theo tỷ lệ 1/200
- Lọc, xử lý kháng sinh, ựể kháng sinh tác ựộng 1 giờ, tiến hành ra chai, dán nhãn, ựóng nút
- Kiểm tra vô trùng - đông khô vacxin - Bảo quản và sử dụng
Câu hỏi ôn tập chương
1. Trình bày những yêu cầu chung về nhân sự và cơ sở vật chất trong sản xuất vacxin. 2. Kế hoạch và tài liệu cho quy trình sản xuất vacxin.
3. Quá trình nhân và giữ giống vi sinh vật cho sản xuất vacxin, cho vắ dụ?
4. Nhân giống, sản xuất, chuẩn bị nguyên vật liệu và môi trường dùng trong sản xuất vacxin.
5. Công tác vệ sinh khu vực sản xuất.
6. Trình bày một số quy trình sản xuất vacxin vi khuẩn (vacxin phó thương hàn lợn vô hoạt, vacxin nhiệt thán, vacxin tụ dấu).
7. Trình bày một số quy trình sản xuất vacxin virus (vacxin virus nhược ựộc trên phôi trứng, qui trình sản xuất vacxin bằng công nghệ lựa chọn kháng nguyên).
Chương 3
KIỂM NGHIỆM VACXIN
Mục tiêu:
Nắm ựược nội dung của quá trình kiểm nghiệm vacxin.
Kiến thức cơ bản:
+ Tiêu chuẩn của một phòng kiểm nghiệm vacxin ựộng vật.
+ Các chỉ tiêu vacxin cần kiểm nghiệm và phương pháp kiểm nghiệm vacxin. + Quy trình kiểm nghiệm của một số loại vacxin.
Trước khi phân phối, thành phẩm vacxin cần phải ựược kiểm nghiệm.
Kiểm nghiệm là thực hiện các phương pháp kiểm tra tổng thể chất lượng của loại vacxin vừa hoàn thành theo quy trình sản xuất, ựảm bảo lô vacxin xuất xưởng phải có ựộ tinh khiết, an toàn và có hiệu lực.
Các bước kiểm nghiệm phải ựược tiến hành tại cơ sở sản xuất (kiểm nghiệm theo tiêu chuẩn cơ sở) và kiểm nghiệm tại cơ quan pháp chế Quốc gia, ở Việt Nam là Trung tâm kiểm nghiệm thuốc và vacxin thú y - Cục Thú ỵ
Sau khi có ựầy ựủ hồ sơ pháp chế, vacxin mới ựược xuất xưởng, lưu hành.
Ị TIÊU CHUẨN CỦA MỘT PHÒNG KIỂM NGHIỆM VACXIN đỘNG VẬT
1. Phòng kiểm nghiệm vacxin vi khuẩn, virus và pha chế môi trường phải tách rời nhaụ
2. Thiết bị và máy móc phục vụ cho các khâu kiểm nghiệm phải ựầy ựủ và ựạt tiêu chuẩn quy ựịnh.
3. Thiết kế phù hợp, dễ vệ sinh, sàn và tường không thấm nước và chịu ựược hóa chất. 4. Có các buồng an toàn về vi sinh vật bảo vệ ựược sản phẩm và người thao tác. 5. Có hệ thống thông gió tốt và an toàn.
6. Trang thiết bị bảo hộ tốt.
7. Phải có khu nhà nuôi ựộng vật thắ nghiệm bao gồm:
Nhà nuôi gia cầm;
Nhà nuôi gia súc nhỏ;
Nhà nuôi gia súc lớn.
Mỗi nhà nuôi này có 2 khu tách biệt dành cho kiểm nghiệm vacxin vi khuẩn và vacxin virus.
Kết cấu của nhà nuôi phải ựảm bảo an toàn sinh học, có nghĩa là khi tiến hành công cường ựộc, các vi sinh vật cường ựộc không ựược gây ô nhiễm ra môi trường bên ngoàị
Với yêu cầu như vậy phòng phải có:
Phương tiện ựốt xác ựộng vật, hệ thống vệ sinh tiêu ựộc triệt ựể.
Hệ thống thông gió ra vào phòng phải qua một hệ thống lọc hiệu quả.
Có ựầy ựủ các phương tiện cách lỵ
Hệ thống nước thải phải ựược xử lý an toàn sinh học trước khi thải ra ngoài khu vực.
IỊ CÁC CHỈ TIÊU VACXIN CẦN KIỂM NGHIỆM VÀ PHƯƠNG PHÁP KIỂM NGHIỆM 2.1. Các chỉ tiêu kiểm nghiệm
2. An toàn 3. Hiệu lực
2.2. Phương pháp kiểm nghiệm
2.2.1. Lấy mẫu và bảo quản mẫu
Mẫu kiểm nghiệm là các ựơn vị sản phẩm ựược lấy ra từ các lô vacxin ựể tiến hành kiểm nghiệm trước khi xuất ra sử dụng và lưu giữ trong thời gian bảo quản của vacxin ựể giải quyết các tranh chấp nếu có.
Mẫu phải có tắnh ựại diện, lấy ngẫu nhiên tỷ lệ quy ựịnh và ựược bảo quản trong ựiều kiện phù hợp và an toàn, khi ựến phòng kiểm nghiệm phải ựược tiến hành ngay các thủ tục kiểm nghiệm trong thời gian ngắn nhất.
Các nhà sản xuất cũng nên giữ mẫu này trong vòng 6 tháng sau khi hết hạn sử dụng ghi trên nhãn vì chúng có thể giúp ựánh giá những vấn ựề xảy ra trong quy trình sử dụng vacxin.
Lấy mẫu:
Mẫu ựược lấy theo lô vacxin. Lô vacxin là toàn bộ các sản phẩm ựược chia vào vật chứa cuối cùng từ cùng một khối lượng vacxin ựồng nhất, trong cùng một ca sản xuất. Mẫu ựược lấy theo tỷ lệ sau:
- 10% sản phẩm (ắt nhất là 5) ựối với lô dưới 100 sản phẩm. - 10% sản phẩm với lô từ 100 ựến dưới 500 sản phẩm.
- 2% sản phẩm ựối với lô từ 500 sản phẩm trở lên (nhiều nhất là 20 sản phẩm).
Mẫu lấy xong phải ựược bao gói, dán nhãn và bảo quản ở ựiều kiện bảo quản của vacxin.
Nhãn phải ghi rõ: - Nơi sản xuất - Tên sản phẩm
- Số lôẦ, ngày Ầtháng Ầ năm Ầ sản xuất - Số lượng và ựặc ựiểm sản phẩm
- Người lấy mẫu - Thời gian lấy mẫu - điều kiện bảo quản.
Sử dụng mẫu: mẫu ựược chia làm 3 nhóm như sau:
- Nhóm 1: từ 3 sản phẩm trở lên, dùng ựể kiểm tra thuần khiết. - Nhóm 2: từ 3 sản phẩm trở lên dùng ựể kiểm tra các chỉ tiêu khác. - Nhóm 3: 2 sản phẩm ựể lưu giữ.
Trong trường hợp mẫu có số lượng tối thiểu (5 sản phẩm) thì nhóm 1 và 2 gộp làm một.
2.2.2. Các phương pháp kiểm nghiệm
Mỗi loại vacxin có một quy trình kiểm nghiệm ựược chấp nhận bởi cơ quan có thẩm quyền quốc giạ Nội dung kiểm nghiệm chung bao gồm:
. Kiểm tra ựộ thuần khiết
độ thuần khiết của vacxin ựược xác ựịnh bằng các kiểm tra việc nhiễm tạp khuẩn. Các xét nghiệm xác ựịnh sự nhiễm khuẩn ựược tiến hành trên giống gốc, giống sản xuất, môi trường tế bào nguyên thủy, các thành phần có nguồn gốc ựộng vật như huyết thanh bê và mỗi lô sản phẩm trước khi mang ra sử dụng.
Các phương pháp sử dụng ựể ựảm bảo ựộ tinh sạch của sản phẩm thay ựổi tùy theo bản chất của sản phẩm, ựược mô tả chi tiết trong quy trình kiểm nghiệm hoặc trong quy trình sản xuất của từng loại vacxin (tiêu chuẩn kiểm nghiệm cơ sở).
* để xác ựịnh vi sinh vật ngoại lai là vi khuẩn, Mycoplasma và nấm, người ta cấy mẫu vào các môi trường nuôi cấy thắch hợp, nuôi cấy ở nhiệt ựộ tối ưu trong vòng 14 giờ rồi ựọc kết quả.
* Môi trường sử dụng:
Môi trường phát hiện vi khuẩn gồm: Môi trường nước thịt pepton Môi trường nước thịt gan yếm khắ Môi trường thạch máu
Môi trường thạch thường
Môi trường ựặc biệt (tùy yêu cầu).
Môi trường phát hiện nấm: Sabouraud
SCD (Soybeancasein digest)
Với môi trường lỏng ựược ựựng trong ống φ16, mỗi ống chứa 15ml môi trường.
Tiến hành:
Mẫu thử
Loại môi trường
Số lượng môi trường Số lượng mẫu cấy Nhiệt ựộ nuôi Thời gian theo dõi (ngày) Huyết thanh Nước thịt Thạch máu
Nước thịt gan yếm khắ SCD 4 ống 4 ống 4 ống 4 ống 1ml/ống 370C 370C 370C 20 - 250C 14 ngày Giống gốc (virus) Nước thịt Thạch máu
Nước thịt gan yếm khắ SCD 4 ống 4 ống 4 ống 4 ống 1ml/ống 370C 370C 370C 20 - 250C 14 ngày Hỗn dịch tế bào Nước thịt Thạch máu
Nước thịt gan yếm khắ SCD 4 ống 4 ống 4 ống 4 ống 1ml/ống 370C 370C 370C 20 - 250C 14 ngày Vacxin bán thành phẩm Nước thịt Thạch máu
Nước thịt gan yếm khắ SCD 4 ống 4 ống 4 ống 4 ống 1ml/ống 370C 370C 370C 20 - 250C 14 ngày Vacxin thành phẩm Nước thịt Thạch máu
Nước thịt gan yếm khắ SCD 4 ống 4 ống 4 ống 4 ống 1ml/ống 370C 370C 370C 20 - 250C 14 ngày * đánh giá kết quả:
- đến cuối quá trình theo dõi mà tất cả các ống thử ựều trong suốt, mầu sắc môi trường không ựổi, kết quả là âm tắnh.
- Nếu có một trong các ống thử có biểu hiện nhiễm trùng thì phải tiến hành nhuộm và soi kắnh ựể xác ựịnh loại vi khuẩn, ựồng thời kiểm tra lại lần 2 với số mẫu như trên. Nếu lần 2 âm tắnh thì mẫu ựược coi là âm tắnh.
- Nếu lần 2 cũng dương tắnh và cùng loại tạp khuẩn như lần 1 thì mẫu ựó ựược coi là dương tắnh. Loạt vacxin hay lô có mẫu kiểm tra phải loại bỏ.
với cách thức như trên.
* Xác ựịnh virus ngoại lai: Tùy theo yêu cầu kiểm tra loại virus ngoại lai, dựa vào ựặc tắnh của virus mà lựa chọn những phương pháp thắch hợp.
Vắ dụ: Với virus gây ngưng kết hồng cầu có thể kiểm tra bằng phản ứng HẠ
Virus gây bệnh Leucosis, viêm màng não, SV40... có thể sử dụng PCR, các phản ứng huyết thanh học như ELISA, miễn dịch huỳnh quang, thậm chắ có thể gây nhiễm trên tế bào hoặc qua phôi trứng.
Những biện pháp trên cũng có thể áp dụng ựể kiểm tra các loại vacxin vô hoạt ở góc ựộ: quá trình vô hoạt ựã triệt ựể hay chưạ
. Kiểm tra ựộ an toàn
An toàn là chỉ tiêu quan trọng của một loại vacxin. Một vacxin khi sử dụng phòng bệnh cho ựộng vật phải ựạt ựược chỉ tiêu nàỵ
độ an toàn thực chất của một vacxin phải ựược chứng minh sớm trong giai ựoạn hình thành sản phẩm và sau khi sản xuất.
Xác ựịnh chỉ tiêu an toàn phải ựược tiến hành qua nhiều bước thử trong phòng thắ nghiệm, trên thực ựịa, ở quy mô nhỏ và ựại trà.
* Kiểm tra khả năng tăng ựộc lực: Yêu cầu này ựược thực hiện với các loại vacxin sống. Khi sử dụng vacxin sống tiêm cho vật chủ, các vi sinh vật có thể từ ựó lây lan sang những ựộng vật tiếp xúc với nó và có thể gây thành bệnh nếu như vi sinh vật vẫn còn ựộc lực hoặc trở nên có ựộc lực trở lạị Do vậy, tất cả các loại vacxin nhược ựộc cần phải kiểm tra ựộc lực bằng phương pháp tiêm truyền. Vi sinh vật trong vacxin ựược cấy chuyển in vivo bằng cách gây nhiễm vacxin cho một nhóm ựộng vật cảm thụ với giống gốc luôn dùng ựường mắc bệnh tự nhiêm với loài ựộng vật ựó. Sau ựó, vi sinh vật vacxin ựược thu nhận lại từ mô bào hay chất bài tiết của ựộng vật ựã gây nhiễm trên ựược dùng ựể gây nhiễm cho nhóm ựộng vật khác. Sau không ắt hơn 5 lần cấy chuyển như vậy, chủng vi sinh vật ựược phân lập lại và ựược kiểm tra ựầy ựủ các ựặc tắnh sinh học và ựộc lực như phương pháp kiểm tra giống gốc.
Vi sinh vật vacxin phải có ựộc lực giảm và ổn ựịnh có thể chấp nhận ựược sau khi cấy chuyển theo cách nàỵ
* Kiểm tra nguy cơ với môi trường:
Vacxin sống có thể bài thải, làm lây lan cho ựộng vật mẫn cảm hoặc không mẫn cảm và gây hại cho môi trường. Vì thế cần tiến hành kiểm tra nguy cơ ô nhiễm vi sinh vật vacxin (nếu có) ựể khi sử dụng vacxin cần có những biện pháp khống chế.
Vắ dụ: Vacxin nhược ựộc nha bào nhiệt thán khi tiêm phải hạn chế rơi rớt ra bên ngoài, bơm tiêm và lọ vacxin dùng xong phải tiêu ựộc...
* Kiểm tra tắnh an toàn của vacxin trước khi sử dụng cho ựộng vật:
Các kiểm tra an toàn với một lô sản phẩm vacxin thường ựược tiến hành bằng cách tiêm cho ựộng vật thắ nghiệm (chuột nhắt, chuột lang, mèo, chó, lợn, gia cầm) hoặc cho bản ựộng vật tùy theo quy trình chỉ dẫn.
Việc kiểm tra này ựược thực hiện theo các bước: