V. YÊU CẦU CỦA MỘT VACXIN
6.4. Vacxin thế hệ mới sản xuất bằng công nghệ gen
6.4.1. Khái niệm
protein, ựặc biệt là kỹ thuật gen học và công nghệ sinh học phân tử ựã mở ra một hướng ứng dụng mới ựó là nghiên cứu sản xuất các loại hình vacxin bằng công nghệ gen. Những loại vacxin tạo ra bằng phương pháp này ựược gọi là vacxin thế hệ mới nhằm phân biệt với các loại vacxin ựã có ựược nghiên cứu sản xuất bằng phương pháp công nghệ truyền thống.
Một vacxin ựược gọi là vacxin thế hệ mới phải là thành phẩm của một quy trình có sự can thiệp, sử dụng, thao tác của công nghệ gen.
Hiện nay, nhiều loại vacxin thế hệ mới ựã và ựang ựược ựưa vào sử dụng có hiệu quả, góp phần vào việc phòng chống bệnh tật cho người và ựộng vật.
6.4.2. Nguyên lý
Trong một loại vacxin, yếu tố quyết ựịnh tắnh sinh miễn dịch chắnh là thành phần protein ựặc biệt có trên bề mặt của vi sinh vật gây bệnh. Thành phần protein này ựược gọi là kháng nguyên và do một gen hay một số gen có trong hệ gen của vi sinh vật gây bệnh quyết ựịnh tổng hợp nên. Những gen chịu trách nhiệm về việc tổng hợp (hay sản xuất) protein kháng nguyên ựược gọi là gen kháng nguyên.
Nếu tách gen kháng nguyên khỏi vật liệu di truyền của vi sinh vật rồi ghép vào một hệ thống plasmid vector thắch ứng nào ựó thì gen kháng nguyên này vẫn hoạt ựộng như khi tồn tại trong hệ gen của vi sinh vật chủ và phân tử protein kháng nguyên ựược tổng hợp ra vẫn có thể có chức năng như cũ, tức là có tắnh sinh miễn dịch. Chế phẩm protein kháng nguyên ựược tạo ra như thế ựược gọi là vacxin tái tổ hợp gen hay vacxin thế hệ mới - vacxin công nghệ gen.
6.4.3. Phân loại
Vacxin thế hệ mới có nhiều loạị Căn cứ vào nguồn kháng nguyên nhân lên ựược hay không nhân lên trong cơ thể ựộng vật, người ta chia vacxin thế hệ mới làm 2 loại:
Vacxin có kháng nguyên sống ựược nhân lên, bao gồm:
Vacxin tái tổ hợp có vector dẫn truyền
Loại vacxin này chứa 2 thành phần chắnh:
- đoạn ADN chứa gen mã hóa cho kháng nguyên chắnh ựược tách ra từ vi sinh vật gây bệnh.
- Hệ gen của vector dẫn truyền.
Người ta tách rời gen kháng nguyên từ vi sinh vật gây bệnh rồi ghép vào hệ gen của vector dẫn truyền là plasmid hay vi sinh vật rồi ựưa vào vật chủ. Là vi sinh vật sống nên khi gây nhiễm, chúng sẽ nhân lên do ựó nguồn gen kháng nguyên và sản phẩm của gen kháng nguyên là protein kháng nguyên luôn ựược sản xuất ra tạo miễn dịch lâu bền cho cơ thể.
* Các vector dẫn truyền:
Hiện nay các vector dẫn truyền ựược chọn thường là những sinh vật (vi khuẩn, virus, nấm men, thực vật) thông dụng có thể nhân lên ựược ở nhiều loài ựộng vật và ựã ựược làm giảm ựộc hoặc vô ựộc bằng kỹ thuật gen.
Vắ dụ như vi khuẩn Salmonella typhimurium: ựây là loại vi khuẩn không ựộc ựược chọn làm vector dẫn truyền vì có các ưu ựiểm:
- Dễ sử dụng qua ựường tiêu hóạ
- Có thể tồn tại và nhân lên ở tổ chức lympho ựường tiêu hóa, cung cấp protein kháng nguyên bền vững ựể gây ựáp ứng miễn dịch toàn diện: dịch thể, tế bào và miễn dịch cục bộ.
Hình 1.1: Mô phỏng quy trình tạo vacxin tái tổ hợp véctơ dẫn truyền
Hiện nay Salmonella typhimurium ựược sử dụng phổ biến làm vector dẫn truyền ựể sản xuất các vacxin: cúm, viêm gan B, sốt xuất huyết, thổ tả, liên cầu khuẩn, ký sinh trùng sốt rét...
Ngoài Salmonella typhimurium, người ta còn sử dụng vi khuẩn Ẹcoli và một số loài nấm men như Pichia pastoris hoặc Sacharomyces cerevisiae làm vector dẫn truyền.
+ Virus ựậu bò vaccinia: Virus vaccinia thuộc nhóm Orthopoxvirus ựã ựược sử dụng một thời kỳ dài làm vacxin phòng bệnh ựậu mùa (small fox).
Hệ gen của vaccinia có 200.000 nucleotit và có khả năng tiếp nhận nhiều gen ngoại lai có ựộ dài 25.000 nucleotit do ựó là vector lý tưởng ựể sản xuất vacxin ựa giá. Mặt khác virus vaccinia có khả năng gây nhiễm vào nhiều loại vật chủ nhưng không gây bệnh, cũng vậy, có thể nhân lên trong nhiều loại tế bào nuôi cấy, thậm chắ ở nhiều dòng tế bào mà ở ựó chúng không hoàn thiện ựược chu trình nhân lên do ựó không bị dung bào nên rất thuận tiện ựể làm vector. Virus vaccinia tái tổ hợp có thể biểu hiện gen kháng nguyên sớm và sản xuất ra protein kháng nguyên gây ựáp ứng miễn dịch toàn diện.
Các vacxin sử dụng virus vaccinia làm vector dẫn truyền như: - Vacxin ND với gen mã hóa kháng nguyên F
- Vacxin cúm với gen mã hóa kháng nguyên H và N
- Vacxin viêm gan B với gen mã hóa bề mặt HBS - Ag (Hepatitis B surface Antigen).
Vacxin axit nucleic (vacxin ADN)
đây là vacxin có thành phần chắnh là ADN của plasmid tái tổ hợp chứa gen kháng nguyên.
Gen mã hóa cho kháng nguyên của vi sinh vật gây bệnh ựược tạo dòng rồi gắn vào plasmid. đưa plasmid tái tổ hợp vào cơ thể bằng cách vi tiêm hoặc bằng súng bắn gen.
Vacxin thường ựược tiêm vào cơ thể ựể ựưa gen trực tiếp vào một số tế bào cơ. Khi vào trong tế bào, ADN của plasmid tái tổ hợp ựược nhân lên, protein kháng nguyên ựược sản sinh trực tiếp bởi tế bào vật chủ, chúng sẽ kắch thắch cơ thể sản sinh miễn dịch.
Ưu ựiểm của vacxin ADN:
- Gen kháng nguyên biểu thị mạnh, thời gian sản xuất kháng nguyên lâu do ựó tạo miễn dịch mạnh và lâu bền nên không cần tiêm nhắc lạị
- Vacxin ADN rất an toàn vì gen ựộc ựã ựược loại trừ, hiệu lực ổn ựịnh, dễ bảo quản,
Virus ựậu tái tổ hợp Nuôi cấy tế bào Chọn lọc
Virus ựậu vectơ Gen vacxin Khởi phát TAX Kết thúc ATT hoặc ATX cắt nối gen vacxin điểm mầm Vị trắ cắt Vùng khởi ựộng Plasmid Plasmid tái tổ hợp
thuận tiện cho việc sử dụng, có ý nghĩa kinh tế.
- Tạo miễn dịch tốt ở những cơ thể bị suy giảm miễn dịch và cơ thể suy nhược.
- Có thể thiết kế một vacxin ựa giá do trên cùng một plasmid gắn nhiều gen mã hóa hoặc trộn nhiều loại plasmid có chứa ADN mã hóa cho các loại protein kháng nguyên khác nhau mà hỗn hợp vacxin ADN này không bị ảnh hưởng lẫn nhau, như thế sẽ ựơn giản hóa ựược tiến trình tiêm chủng.
Nhược ựiểm:
Thực nghiệm cho thấy khi ựưa vacxin ADN vào cơ thể ựộng vật, sự phân bố ADN vacxin trong tế bào không ựạt ựược mức tối ựạ Mặt khác, nếu ADN vacxin hòa nhập vào hệ gen của ựộng vật chủ sẽ gây hậu quả về di truyền ở các thế hệ tiếp theo hoặc có thể ựột biến tế bào gây ung thư hoặc ức chế sự hoạt ựộng của gen chống ung thư, gây biến ựổi tế bào dẫn ựến trạng thái tự miễn dịch.
Vacxin ADN thuộc thế hệ mới nhất, ựược coi là loại vacxin có triển vọng lớn. Hiện tại vacxin này mới ựược nghiên cứu thử nghiệm trên ựộng vật như:
Vacxin ADN chứa gen HBsAg
Vacxin ADN chứa gen kháng nguyên chủ yếu của HIV Vacxin ADN chứa gen H và N chống cúm
Vacxin hóa gen ựộc: Là vacxin chứa yếu tố gây bệnh ựược làm nhược ựộc bằng kỹ thuật gen cắt bỏ gen ựộc.
Vắ dụ: để tạo ra giống gốc sản xuất vacxin cúm gia cầm, hiện tại Bộ Y tế và Viện khoa học công nghệ Việt Nam nhập ngoại chủng virus vacxin NiBRG - 14 từ Viện Tiêu chuẩn và Kiểm nghiệm dịch sinh phẩm Quốc gia - Vương quốc Anh thông qua WHỌ Chủng NiBRG - 14 ựược tạo ra bằng kỹ thuật di truyền ngược thông qua việc ghép 6 gen của chủng /PR8/34 (H1N1) với 2 gen H5N1 của chủng A/Vietnam/1194/2004 (H5N1). Riêng gen H5 bị loại 12 nucleotit mã hóa 4 axit amin thuộc vùng ựộc, chủng virus này có thể nuôi cấy trên phôi gà.
Vacxin Aujeski cũng là một vacxin nhược ựộc kiểu nàỵ
Vacxin có nguồn gốc kháng nguyên không nhân lên
đây là các loại vacxin vô hoạt sản xuất bằng kỹ thuật gen bao gồm:
Vacxin chứa kháng nguyên là protein sản xuất bằng kỹ thuật gen
Loại vacxin này ựược sản xuất bằng cách tách gen kháng nguyên từ tác nhân gây bệnh, ghép vào hệ gen của một loại vi sinh vật làm vector dẫn truyền (vi khuẩn, virus, nấm men), nuôi cấy vi sinh vật tái tổ hợp này trong môi trường thắch ứng như hệ thống bioreactor hoặc thiết bị lên men lớn, lượng protein sẽ ựược sản xuất với số lượng nhiều sau ựó.
Chiết tách protein kháng nguyên ựể làm vacxin.
Vacxin ăn ựược
Dùng thực vật là bioreactor ựể sản xuất dược chất protein là một xu thế phát triển của công nghệ sinh học. Nhiều gen mã hóa kháng nguyên virus ựược chuyển vào thực vật và ựã biểu hiện với hiệu quả caọ Vì vậy, sản xuất vacxin ăn ựược là hướng nghiên cứu có triển vọng, vacxin ăn ựược có hoạt tắnh tương tự vacxin thông thường, chỉ khác là vacxin này ựược thực vật sản xuất trong những phần ăn ựược như lá, củ, quả và hạt.
Nỗ lực sản xuất vacxin ăn ựược từ thực vật ựầu tiên ựược ghi nhận vào năm 1990 bởi 2 nhà khoa học Curtis và Cardineu khi biểu hiện thành công protein kháng nguyên bề mặt A của vi khuẩn Streptococcus mutans ở cây thuốc lá. Sau ựó nhiều thành công khác về vacxin thực vật ựã ựược công bố sản xuất trên nhiều loại cây khác nhau như rau diếp, cà chua, khoai tây, lúa mì, ựậu tương và ngô... Số lượng các công trình nghiên cứu về vacxin ăn ựược ngày một gia tăng ựã
chứng tỏ tắnh ưu việt của thực vật như một hệ thống biểu hiện protein kháng nguyên hiệu quả cao, chi phắ sản xuất thấp, an toàn sinh học, sử dụng bảo quản dễ dàng do không phải giữ lạnh. Mặt khác, gọi là vacxin ăn ựược là ựề cập ựến sự chấp nhận của cơ thể ựộng vật, tức là vacxin bền vững trong dịch tiêu hóa, sau khi ăn vào, vacxin không bị phân hủy và có khả năng kắch thắch ựáp ứng miễn dịch mạnh.
Người ta dùng thuật ngữ ỘPlan edible vacxinỢ ựể chỉ loại vacxin ăn ựược sản xuất từ thực vật biến ựổi gen nàỵ
Nguyên lý sản xuất vacxin ăn ựược: Vacxin ăn ựược là loại vacxin tiểu phần bao gồm một hoặc nhiều chuỗi polypeptit của protein kháng nguyên trong vi sinh vật gây bệnh, người ta chọn lọc những gen mã hóa cho các thành phần này, ựưa vào vector (plasmid hoặc vi khuẩn, vắ dụ Agrobacterium tumefaciens), dựa vào hệ thống di truyền thực vật ựể khuyếch ựại gen và biểu hiện thành các protein kháng nguyên mong muốn trong các bộ phận ăn ựược của thực vật.
Bảng 1.6: Các thành tựu nghiên cứu vacxin ăn ựược ựã ựược công bố
Nguồn protein Protein/Peptit đối tượng
thực vật đáp ứng miễn dịch
Tác giả, năm báo cáo
Ẹcoli Tiểu phần B - ựộc tố kém chịu nhiệt LT - B Thuốc lá Khoai tây Kháng thể dịch thể và kháng thể tế bào theo
ựường uống và ăn
Hag et al, 1995
Vibrio cholerac độc tố tả
Tiểu phần B Khoai tây Cho ăn Arakawa, 1998
Virus viêm gan B HBs - Ag Thuốc lá Chưa thử nghiệm Mason et al, 1992
Virus dại Glycoprotein Cà chua McGarvey et al, 1995
Cl.tetani Ngoại ựộc tố Lục lạp
thuốc lá Cho ăn Tregoing et al, 2003
Vacxin peptit tổng hợp: là vacxin thành phần chỉ chứa duy nhất polypeptit kháng nguyên (8 - 20 axit amin)
Do chỉ có các epitop kháng nguyên nên không có khả năng kắch thắch sinh miễn dịch vì vậy sau khi các peptit ựược tổng hợp, người ta phải gắn chúng vào các giá ựỡ ựó là các hạt polyme có khả năng hấp phụ caọ
Vắ dụ: Vacxin peptit phòng bệnh lở mồm long móng, việc bảo hộ ựạt ựược bằng cách tiêm cho ựộng vật một tập hợp các chuỗi peptit kháng nguyên gồm 20 axit amin.
Vacxin peptit có nhiều ưu ựiểm như:
- Sản xuất và kiểm soát chất lượng ựơn giản.
- Không có các thành phần không cần thiết như nucleic, protein ngoại lai do ựó ắt ựộc. - Có thể thay ựổi theo sự biến ựổi tự nhiên ựối với những virus không ổn ựịnh như
virus cúm.
- Có tắnh khả thi thậm chắ trong trường hợp không nuôi cấy ựược virus. - Ổn ựịnh, giá thành hạ.
Tuy nhiên, nhược ựiểm của loại vacxin này là:
- Sinh miễn dịch có thể kém so với các vacxin vô hoạt truyền thống. - Bắt buộc phải có chất bổ trợ.