TP. Mỹ Tho đã hình thành khá sớm và liên tục phát triển cho đến nay. Vào năm 1679, một nhóm khoảng ba ngàn người Minh Hương được Chúa Nguyễn cho định cư vùng đất mới này. Trong nhóm có Dương Ngạn Địch đứng ra lập Mỹ Tho đại phố ở làng Mỹ Chánh, huyện Kiến Hòa. Khu đại phố này kéo dài đến Cầu Vĩ, Gò Cát, tức khu vực xã Mỹ Phong hiện nay. Rất nhiều làng xã mọc lên xung quanh
khu vực Mỹ Tho: Thái Trấn lập làng An Hoà (sau đổi là Thạnh Trị), Nguyễn Văn Trước lập làng Điều Hòa.
Vào thế kỷ 17, Mỹ Tho đã trở thành một trong hai trung tâm thương mại lớn nhất Nam Bộ lúc bấy giờ (trung tâm còn lại là Cù lao Phố, Biên Hòa). Sự hưng thịnh của phố chợ Mỹ Tho cho thấy nền sản xuất nông - ngư nghiệp và kinh tế hàng hóa địa phương ở thời điểm đó đã có những bước phát triển đáng kể, đặc biệt là đối với ngành thương mại.
Năm 1772, Mỹ Tho thuộc đạo Trường Đồn, đến năm 1779 đạo Trường Đồn được nâng lên thành dinh Trường Đồn. Năm 1781, dinh Trường đồn lại đổi tên thành dinh Trấn Định. Đến năm 1785, quân Xiêm đã tràn sang và biến nơi đây thành bãi chiến trường (Trận Rạch Gầm - Xoài Mút). Phố xá bị tàn phá, của cải bị cướp bóc nên Mỹ Tho đại phố trở nên tiêu điều. Thương nhân ở đây hầu hết đều chuyển lên làm ăn ở Sài Gòn - Bến Nghé. Năm 1788, mặc dù được khôi phục dần, nhưng không còn nhộn nhịp như trước. Đến năm Nhâm Tý (1792), Chúa Nguyễn cho dời lỵ sở dinh Trấn Định về chợ Mỹ Tho thuộc thôn Mỹ Chánh (khu vực Chợ Cũ thuộc phường 2, 3 và 8 ngày nay) và cũng tại đây chúa Nguyễn đã cho xây dựng thành Trấn Định. Thành được xây theo đồ họa kiến trúc của ông Trần Văn Học.
Năm 1826, vua Minh Mạng lại cho dời lỵ sở trấn Định Tường sang phía tây sông Bảo Định thuộc hai thôn Điều Hòa và Bình Tạo của huyện Kiến Hưng (nay thuộc các phường 1, 4 và 7), phủ Kiến An, tỉnh Định Tường. Cũng trong năm này, ông Dương Tấn Tuyên lập một ngôi chợ bên cạnh thành mới tại khu vực chợ Mỹ Tho ngày nay.
Mỹ Tho luôn luôn là trị sở, tỉnh lị tỉnh Định Tường và đến năm 1900 trở thành tỉnh lị tỉnh Mỹ Tho khi tỉnh này được thành lập.
Mỹ Tho từng có đường xe lửa nối với Sài Gòn dài 71 km, khánh thành ngày 20 tháng 7 năm 1885, bị phá hỏng thời chống Pháp.
Năm 1956, Chính quyền Việt Nam Cộng hòa lập lại tỉnh Định Tường, giải thể thị xã Mỹ Tho, nhập địa bàn vào xã Điều Hòa. Ngày 30 tháng 9 năm 1970,
Chính quyền Việt Nam Cộng hòa cải biến xã Điều Hòa thành thị xã Mỹ Tho, đến ngày 10 tháng 6 năm 1971, chia địa bàn thành 6 khu phố.
Cuối năm 1976, thị xã Mỹ Tho được Chính phủ Cách mạng Lâm thời Cộng hòa miền Nam Việt Nam nâng lên thành TP. Mỹ Tho, trực thuộc Khu 8.
Từ năm 1976 đến 2005, Mỹ Tho được công nhận là thành phố loại 3 và từ 2005 là đô thị loại 2.