Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1.1. Khảo sát điều kiện sắc ký và điều kiện thủy phân
Khảo sát hệ dung mơi pha động: Kết quả khảo sát cho thấy: các hệ dung mơi pha
động chỉ cĩ MeOH và dung dịch acid đã khơng tách được K và I vốn là 2 chất cĩ cấu trúc hĩa học gần giống nhau nên rửa giải rất gần nhau và khĩ tách.
Với mục tiêu xây dựng một điều kiện sắc ký với hệ dung mơi đơn giản, kiểu rửa giải đẳng dịng, tách được hồn tồn 3 pic Q, K, I để đồng thời áp dụng trên nguyên liệu và chế phẩm nên đề tài khảo sát pha động gồm 3 thành phần: MeCN, MeOH và dung dịch acid phosphoric (nồng độ từ 0,1-0,5%) trên cột Phenomenex Gemini C18. Kết quả với hệ dung mơi đẳng dịng gồm MeCN và hỗn hợp acid phosphoric 0,2% – MeOH (60:16) với tỉ lệ (27:73) tách được pic K và I.
Khảo sát tốc độ dịng: Khảo sát ở 3 tốc độ 1,0; 1,2 và 1,5 mL/ phút. So với 1,0 mL/ phút thì tốc độ dịng 1,2 và 1,5 mL/ phút cĩ thời gian phân tích ngắn hơn nhưng do cĩ một chất tạp nhỏ rửa giải gần Q gây nhiễu đường nền làm pic Q khơng
đạt yêu cầu về độ tinh khiết (Hình 3-1). Do đĩ, hệ pha động gồm MeCN và hỗn hợp acid phosphoric 0,2% – MeOH (60:16) với tỉ lệ (27:73), tốc dộ dịng 1,0 mL/ phút được chọn. Các thơng số sắc ký của các pic Q, K, I đều đạt yêu cầu của một pic sắc ký và các pic đều tinh khiết > 99%.
(a) m i n 0 5 10 15 20 25 m A U 0 10 20 30 40 9. 79 3 10 .74 2 1 8 .4 1 8 19 .6 77 Q K I m i n 0 5 10 15 20 25 m A U 0 10 20 30 40 Q K I 1 0 .3 9 9 1 8 .0 3 4 19. 08 4 (b) m i n 0 5 10 15 20 25 m A U 0 5 10 15 20 8. 29 1 1 4 .8 2 8 15 .8 64 I K Q (c)
Hình 3-1. Sắc ký đồ của Q, K, I trong CBQ theo tốc độ dịng: 1,0 ml/phút (a), 1,2 ml/phút (b) và 1,5 ml/phút (c); trên cột Phenomenex Gemini C18 250 x 4,6 mm, 5 µm; pha động gồm MeCN và hỗn hợp acid phosphoric 0,2% - MeOH (60:16) với tỉ lệ (27:73); bước sĩng phát hiện 370 nm.
Khảo sát bước sĩng phát hiện: Với hệ pha động gồm MeCN và hỗn hợp acid phosphoric 0,2% – MeOH (60:16) với tỉ lệ (27:73), tốc độ dịng 1,0 mL/ phút, tiến hành sắc ký dung dịch đối chiếu Q, K, I và dung dịch CBQ. Ghi nhận sắc ký đồ và so sánh phổ UV tại thời gian lưu của 3 pic Q, K, I của dung dịch thử với dung dịch
đối chiếu. Các pic flavonol này đều cĩ 2 hấp thụ cực đại ở 370 nm và ở vùng 254- 266 nm (Q: 370 và 256 nm, K: 370 và 266 nm, I: 370 và 254 nm) (Hình 3-2). Tuy nhiên ở 370 nm, cả 3 pic đều cĩ hấp thụ cực đại và cường độ hấp thụ cao hơn tại bước sĩng cịn lại. Ngồi ra, trên sắc ký đồ của CBQ các pic tạp hấp thu ở bước sĩng 254 nm mạnh hơn so với 370 nm. Do đĩ, bước sĩng 370 nm được chọn để
nm 220 240 260 280 300 320 340 360 380
256 nm 370 nm
Querc etin /GBE
nm 220 240 260 280 300 320 340 360 380
370 nm256 nm 256 nm
Querc etin /REF
nm 220 240 260 280 300 320 340 360 380 Kaempferol /GBE 266 nm 370 nm nm 220 240 260 280 300 320 340 360 380 Kaempferol /REF 266 nm 370 nm nm 220 240 260 280 300 320 340 360 380 370 nm 254 nm Is orhamnetin /GB E nm 220 240 260 280 300 320 340 360 380 Is orhamnetin /REF 254 nm 370 nm
Hình 3-2. Phổ UV tại thời gian lưu của Q, K, I trong sắc ký đồ của dung dịch thử CBQ và dung dịch đối chiếu (ĐC)
Như vậy, điều kiện sắc ký được chọn sau đây là thích hợp để định lượng flavonoid tồn phần trong CBQ và viên nang Gilanka®.
- Cột sắc ký: Phenomenex Gemini C18, 250 x 4,6 mm, 5 μm. Cột bảo vệ
Phenomenex Gemini C18, 4 x 3,0 mm, 5 μm.
- Pha động: Dung mơi A – MeCN (73:27). Dung mơi A là hỗn hợp gồm dung dịch acid phosphoric 0,2% – MeOH (60:16).
- Tốc độ dịng: 1,0 mL/ phút. - Thể tích tiêm mẫu: 20 μL.
- Đầu dị PDA: Bước sĩng phát hiện 370 nm. - Nhiệt độ cột: 250C.
- Thời gian sắc ký: 25 phút.
Sắc ký đồ thu được gồm 3 pic chính là Q, K, I theo thứ tự cĩ thời gian lưu khoảng 10,9; 18,7 và 19,9 phút. Những pic này đều đạt yêu cầu về hệ sốđối xứng 0,80 < AS
Kaempferol / CBQ Kaempferol / ĐC Quercetin / CBQ Quercetin / ĐC
< 1,2, hệ số phân giải RS >1,5, hệ số chọn lọc 1,05 < α < 2,0 và hệ số dung lượng 1< k’< 8.
Khảo sát điều kiện thủy phân flavonoid trong CBQ
Quá trình khảo sát điều kiện thủy phân flavonoid trong CBQ đã được tiến hành với dung mơi thủy phân mẫu (MeOH, EtOH), thể tích acid hydrocloric 20% (5, 7,5, 10, 12,5, 15 mL) và thời gian thủy phân mẫu (30, 60, 90, 120, 150 phút). Với thể tích acid hydrocloric 20% cần dùng là 10 mL hoặc 12,5 mL và thời gian thủy phân là 60 phút hoặc 90 phút (mẫu thử B4, C4, B5 và C5) thì tỷ lệ % flavonoid thu được cao hơn so với các điều kiện khác (Hình 3-3). 20% 21% 22% 23% 24% 25% 26% F% 30ph 60ph 90ph 120ph 150ph 5 7,5 10 12,5 15 ml HCl 20% % Flavonoid B4 C4 B5 C5
Hình 3-3. Biểu đồ biểu diễn hàm lượng flavonoid trong CBQ định lượng được theo điều kiện thủy phân với dung mơi là MeOH (n = 3).
Dữ liệu thực nghiệm gồm 4 điều kiện trên (B4, C4, B5 và C5) với dung mơi thủy phân mẫu là MeOH và EtOH, mỗi điều kiện tiến hành thí nghiệm 3 lần. Kết quả
phân tích thống kê cho thấy các điều kiện thủy phân này khác nhau khơng cĩ ý nghĩa (p > 0,05); trong khi đĩ dùng MeOH cĩ kết quả cao hơn và lặp lại hơn so với dùng EtOH (p < 0,05). Do đĩ, MeOH được chọn làm dung mơi để thủy phân mẫu.
Với dữ liệu khảo sát lượng CBQ đem thủy phân trong dung mơi MeOH ở 3 mức 0,125; 0,150 và 0,175 g, mỗi mức tiến hành thí nghiệm 2 lần với mỗi điều kiện thủy phân B4, C4, B5, C5; kết quả tích thống kê cho thấy % flavonol định lượng được
giữa các nhĩm thí nghiệm khác nhau khơng cĩ ý nghĩa thống kê (p > 0,05). Như
vậy, kết quả khơng bịảnh hưởng bởi lượng mẫu cân trong khoảng 0,125 - 0,175 g. Như vậy, điều kiện thích hợp để thủy phân flavonoid trong CBQ được chọn là lấy 0,15 g CBQ, hịa trong 40 mL MeOH, thêm 10 mL acid hydrocloric 20%, đun hồi lưu trong 60 phút. Với điều kiện thủy phân này thì kết quả % flavonol thu được là cao nhất và thời gian xử lý mẫu ngắn, đồng thời lượng acid trong dung dịch tiêm mẫu thấp nên khơng làm giảm tuổi thọ cột sắc ký.
Khảo sát điều kiện thử nghiệm độ hịa tan chế phẩm
Thiết bị khuấy: Cánh khuấy.
Tốc độ khuấy: Với tốc độ 50 vịng/ phút, kết quả khảo sát sơ bộ cho thấy khả năng rã và độ giải phĩng hoạt chất của viên là rất thấp. Do đĩ, đề tài chọn tốc độ 100 vịng/ phút để khảo sát.
Thể tích mơi trường hịa tan: Khảo sát ở 2 điều kiện sau:
− Điều kiện 1: Pha A (HCl 0,1N) = 375 mL, Pha B (thể tích dung dịch đệm thêm vào) = 125 mL và tổng thể tích mơi trường hịa tan = 500 mL.
− Điều kiện 2: Pha A (HCl 0,1N) = 750 mL, Pha B (thể tích dung dịch đệm thêm vào) = 250 mL và tổng thể tích mơi trường hịa tan = 1000 mL.
Kết quả khảo sát cho thấy 500 mL mơi trường hịa tan đã đảm bảo đủ mơi trường cho lượng CBQ trong 1 viên nang cứng Gilanka® phĩng thích và hịa tan; Lượng CBQ hịa tan với thể tích mơi trường hịa tan 500 mL và 1000 mL khác nhau khơng
đáng kể, nhưng với 1000 mL cho kết quả lặp lại tốt hơn. Do đĩ, chọn mơi trường hịa tan là 1000 mL. Kết quảđược thể hiện ở Bảng 3-1.
Khảo sát điều kiện thủy phân mẫu dịch thử nghiệm độ hịa tan
Việc thủy phân mẫu thử độ hịa tan được tiến hành ở điều kiện tương tự phương pháp định lượng flavonoid tồn phần trong nguyên liệu CBQ và chế phẩm
Gilanka®. Do nồng độ chất phân tích ở đây nhỏ hơn rất nhiều so với nồng độ chất phân tích trong dịch định lượng nên đề tài tiến hành khảo sát lại thời gian thủy phân của mẫu ở hai pha A và B trong MeOH với nồng độ HCl là 4%. Kết quảđược thể
hiện ở Bảng 3-2.
Bảng 3-1. Kết quả thăm dị thể tích mơi trường thử độ hịa tan (n = 6)
Lượng flavonoid phĩng thích và hịa tan (%), so với nhãn
Pha A Pha B STT Điều kiện 1 Điều kiện 2 Điều kiện 1 Điều kiện 2 1 31,6 32,3 58,4 62,1 2 30,8 31,0 58,9 61,6 3 31,3 31,5 57,6 62,4 4 30,0 30,7 56,5 60,1 5 29,6 30,9 56,4 61,7 6 31,7 31,2 58,3 60,9 Trung bình 30,8 31,3 57,7 61,5 RSD(%) 2,84 1,87 1,81 1,35
Bảng 3-2. Kết quả khảo sát thời gian thủy phân mẫu thử độ hịa tan (n = 6)
Lượng flavonoid phĩng thích và hịa tan (%), so với nhãn
Pha Thời gian (phút) 1 2 3 4 5 6 Trung bình RSD(%) 30 28,8 28,0 27,6 29,0 29,0 28,7 28,5 2,1 45 30,8 31,0 31,8 32,6 31,7 32,3 31,7 2,2 A 60 30,5 30,2 30,9 31,7 31,2 31,8 31,1 2,1 30 57,3 56,8 56,5 59,0 59,9 59,2 58,1 2,5 45 62,9 62,6 61,6 60,1 62,2 63,8 62,2 2,0 B 60 63,2 61,8 64,5 61,9 60,7 62,0 62,3 2,1 Từ dữ liệu thực nghiệm nêu trên, một số nhận xét cĩ thểđược tĩm tắt như sau: − Thời gian 30 phút thủy phân khơng hồn tồn các flavonol glycosid.
− Ở nồng độ HCl 4% trong dung dịch thủy phân thì thời gian thủy phân 45 phút và 60 phút cho kết quả hàm lượng flavonoid tồn phần khác nhau khơng cĩ ý nghĩa
thống kê (p > 0,05). Do số lượng mẫu thử hịa tan nhiều nên thời gian thủy phân 45 phút được chọn để rút ngắn thời gian xử lý mẫu.
Như vậy, điều kiện thủy phân dịch hịa tan như sau: Lấy chính xác 10 mL dịch thử
hịa tan, cho vào bình cầu, thêm 22 mL MeOH và 8 mL dung dịch acid hydrocloric 20%. Gắn bình cầu vào hệ thống sinh hàn hồi lưu. Đun sơi cách thủy trong 45 phút. Lấy bình cầu ra và làm nguội dưới vịi nước. Chuyển dịch thủy phân vào bình định mức 50 mL. Tráng rửa bình cầu với hỗn hợp MeOH – nước (1:1), cho dịch rửa vào cùng bình định mức 50 mL trên và bổ sung đến vạch với cùng dung mơi. Lắc đều, lọc qua màng lọc 0,45 μm, được dịch tiêm sắc ký.
Khảo sát điều kiện sắc ký mẫu dịch thử nghiệm độ hịa tan
Các mẫu thử sau khi thủy phân, được tiến hành sắc ký theo điều kiện sắc ký đã chọn cho CBQ và Gilanka®. Do nồng độ các flavonoid trong mẫu thửđộ hịa tan quá thấp nên diện tích pic Q, K, I trên sắc ký đồ thu được quá nhỏ. Do đĩ, tăng thể tích tiêm mẫu lên 100 µL để diện tích các pic Q, K, I lớn hơn và kết quả lặp lại hơn.