Do cấu trúc phân tử cĩ nhiều nhĩm hydroxyl (OH) nên các hợp chất Q, K, I là các chất phân cực và cĩ tính acid. Do đĩ cần lựa chọn pha động cĩ tính phân cực để triển khai sắc ký. Tiến hành thăm dị với các hỗn hợp MeOH-nước, MeCN-nước nhưng khơng tách được các chất. Từđây, đề tài tiến hành acid hĩa pha động để tìm cách khắc phục. Mục tiêu là ngăn cản sự ion hĩa flavonoid, cải thiện sự kéo đuơi của pic và tăng độ
phân giải các chất.
Khi thăm dị vai trị của acid phosphoric trong pha động MeCN, nhận thấy: pha động cĩ tính acid thì các pic tách tốt hơn, tuy nhiên thời gian lưu của pic K và I cịn dài (> 20 phút) nên vẫn cịn kéo đuơi. Hiện tượng trên được cải thiện khi thêm MeOH vào pha động: các pic K, I rửa giải sớm hơn và sự kéo đuơi giảm đi. Do đĩ hệ pha động
được chọn gồm 3 thành phần MeCN, MeOH và dung dịch acid phosphoric để tiếp tục khảo sát.
Tiếp tục khảo sát tăng tính acid của pha động bằng cách tăng nồng độ dung dịch acid phosphoric từ 0,1% đến 0,5%. Kết quả cho thấy: nồng độ acid càng cao thì pic Q tách càng tốt. Tuy nhiên nồng độ acid cao cĩ ảnh hưởng đến tuổi thọ của cột sắc ký và đây là yếu tố cần phải cân nhắc.
Pha động chương trình gradient cĩ thể rửa giải các pic K, I sớm hơn, giảm kéo đuơi với
độ phân giải chấp nhận được; nhưng thời gian sắc ký vẫn cịn 25-30 phút và phải mất thời gian cân bằng cột ít nhất 30 phút sau mỗi lần sắc ký. Với mục đích xây dựng chương trình dung mơi đẳng dịng áp dụng cho nguyên liệu CBQ và chế phẩm Gilanka® nên pha động được chọn gồm MeCN và hỗn hợp acid phosphoric 0,2%- MeOH (60:16) với tỷ lệ 27:73. Hệ pha động này tách được 2 pic K và I; và tách được hồn tồn các pic tạp trước pic Q. Các hệ pha động trong các Dược điển khác[48], [75], [76] cũng được khảo sát nhưng kết quả khơng tách được 2 pic K và I cũng như khơng tách được hồn tồn các pic tạp trước pic Q.
Các flavonol cĩ 2 vùng hấp thu cực đại ở khoảng 254 và 370 nm, trong đĩ 254 nm là vùng đặc trưng của flavonoid. Kết quả khảo sát cho thấy: trên sắc ký đồ của CBQ các pic tạp hấp thu ở bước sĩng 254 nm mạnh hơn so với 370 nm trong khi các pic Q, K, I hấp thu ở bước sĩng 370 nm cao hơn so với 254 nm. Do đĩ bước sĩng phát hiện được chọn ở 370 nm.
Với hệ pha động được chọn, hai cột Zorbax C18 và Phenomenex Luna C18 đều cho sắc ký đồ với 3 pic Q, K, I thỏa mãn các yêu cầu sắc ký. Tuy nhiên cột Phenomenex Gemini C18 cĩ khả năng chịu pH cao hơn (pH: 1-12) phù hợp với pH pha động (pH khoảng 2,45) và dung dịch tiêm mẫu (pH: 1-1,5) nên cột Phenomenex Gemini C18
được chọn để nghiên cứu .
Trong thủy phân mẫu CBQ, do hàm lượng K và I trong mẫu CBQ khảo sát thấp hơn nhiều so với Q nên pic cĩ diện tích nhỏ. Do đĩ lượng CBQ được đem thủy phân nhiều hơn so với các tài liệu khác ([47],[52]) nhằm tăng nồng độ chất phân tích để diện tích pic và hệ số đối xứng của pic I lặp lại. Như thế phải pha lỗng mẫu thử với MeOH- nước (1:1) để giảm tính acid của dịch tiêm mẫu và sắc ký đồ cĩ hình dạng tốt hơn.
Do khơng cĩ CBQ chuẩn nên rutin được chọn là chất chuẩn làm việc để đánh giá độ đúng và độ chính xác của quy trình định lượng vì rutin là một quercetin glycosid và cũng là một chất cĩ trong thành phần CBQ.
Việc thẩm định quy trình định lượng flavonoid trong CBQ và viên nang Gilanka®được thực hiện đúng và đầy đủ theo quy định hiện hành [1], [41]: về tính tương thích hệ
thống, tính đặc hiệu, độ tuyến tính, độ chính xác và độ đúng của dịch tiêm mẫu. Kết quả thẩm định đã đưa ra được những thơng số khẳng định sự phù hợp và cĩ độ tin cậy cao. Quy trình này được xây dựng tại Cơng ty CPDP OPC, đơn vị sản xuất đạt tiêu chuẩn GMP-WHO nên phù hợp với điều kiện thực tiễn và mang tính ứng dụng cao.