PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1. Khảo sát điều kiện sắc ký và điều kiện thủy phân Điều kiện sắc ký dự kiến
Điều kiện sắc ký dự kiến
- Cột sắc ký: Phenomenex Gemini C18 (250 mm x 4,6 mm; 5 μm).
- Pha động: Khảo sát hệ dung mơi pha động gồm MeOH, MeCN, acid phosphoric với các tỉ lệ khác nhau để lựa chọn hệ dung mơi pha động thích hợp.
- Tốc độ dịng: Khảo sát tốc độ dịng từ 1,0 đến 1,5 mL/ phút. - Thể tích tiêm mẫu: 20 μL.
- Phát hiện: Đầu dị PDA, khảo sát chọn bước sĩng thích hợp để phát hiện Q, K, I. - Nhiệt độ cột 250C.
Yêu cầu: Sắc ký đồ phải tách được 3 đỉnh chính: Q, K và I. Các đỉnh này phải đạt yêu cầu về hệ số bất đối (AS) trong khoảng 0,8-1,2; hệ số phân giải (RS) >1,5; hệ số chọn lọc 1,05< α <2,0 và hệ số dung lượng 1< k’ <8.
Khảo sát điều kiện thủy phân flavonoid trong CBQ
Qua tham khảo tài liệu nhận thấy để thủy phân CBQ và các chế phẩm chứa CBQ, nồng
phút. Do đĩ, đề tài tiến hành khảo sát dung mơi pha mẫu CBQ (MeOH, EtOH), nồng
độ acid hydrocloric thủy phân từ 2-6% và thời gian thủy phân mẫu từ 30-150 phút. Cụ
thể các yếu tố cần khảo sát như sau:
− Dung mơi pha mẫu CBQ: MeOH, EtOH. − Thời gian thủy phân: 30, 60, 90, 120, 150 phút.
− Thể tích acid hydrocloric 20% cần để thủy phân: 5; 7,5; 10; 12,5; 15 mL. − Lượng mẫu CBQ đem thử: 0,12-0,18 g
Điều kiện thủy phân mẫu tối ưu là điều kiện mà ở đĩ flavonoid trong CBQ được thủy phân hồn tồn cho lượng flavonol tìm thấy nhiều nhất. Kiểm tra sự thủy phân hồn tồn bằng cách tiêm các dung dịch thủy phân trên vào hệ thống HPLC với điều kiện sắc ký thích hợp, so sánh số pic phát hiện trên sắc ký đồ thu được và kết quả diện tích 3 pic chính (Q, K, I).