PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.2. Định lượng flavonoid tp trong CBQ
Xây dựng quy trình định lượng flavonoid tp trong CBQ
Quy trình định lượng flavonoid tồn phần trong CBQ được xây dựng theo các điều kiện đã khảo sát ở mục 2.2.1. Các bước tiến hành được thực hiện theo Sơđồ 2-1.
Lọc 0,45 μm
CBQ
+ V mL HCl 20%
+ MeOH hay EtOH vừa đủ 50 mL, đun hồi lưu cách thủy
Dịch thủy phân
Bình định mức 100 mL (MeOH hoặc EtOH)
Lọc 20 μm
Lấy chính xác 10 mL Bình định mức 25 mL
(MeOH – H2O (1:1) hoặc EtOH– H2O (1:1))
Sắc ký
Sơđồ 2-1. Sơ đồ xử lý mẫu thử CBQ
Thẩm định quy trình định lượng flavonoid tp trong CBQ
Thẩm định quy trình định lượng theo hướng dẫn Bộ Y Tế và USP 29 với các chỉ tiêu: tính tương thích hệ thống, tính đặc hiệu, khoảng tuyến tính, độ chính xác và độ đúng của dung dịch tiêm mẫu.
Khảo sát tính tương thích của hệ thống: Tiêm sắc ký 6 lần liên tiếp dung dịch mẫu thử CBQ để khảo sát tính tương thích của hệ thống.Ghi nhận các thơng số sắc ký: thời
gian lưu (tR), chiều cao (H) và diện tích đỉnh (S), hệ số bất đối (AS), hệ số phân giải (RS), sốđĩa lý thuyết (N), hệ số dung lượng (k’) và hệ số chọn lọc (α) của 3 đỉnh Q, K, I trong sắc ký đồ của dung dịch mẫu thử CBQ.
Tính đặc hiệu: Thời gian lưu của 3 đỉnh chính trong sắc ký đồ của dung dịch thử phải tương đương thời gian lưu của 3 đỉnh Q, K, I trong dung dịch đối chiếu; đồng thời dung dịch mẫu trắng khơng cĩ đỉnh trùng với các đỉnh này. Khi thêm một lượng chất
đối chiếu vào mẫu thử, diện tích đỉnh của hoạt chất phải tăng lên so với trước khi thêm chất đối chiếu. Phổ tử ngoại tại thời gian lưu của 3 đỉnh chính trong mẫu thử phải giống phổ tử ngoại tại thời gian lưu của 3 đỉnh Q, K, I trong dung dịch đối chiếu. Độ
tinh khiết của 3 đỉnh chính trong mẫu thử phải lớn hơn 99%.
Độ tuyến tính: Xác định phương trình hồi quy biểu diễn sự tương quan giữa nồng độ
và diện tích đỉnh của Q.
Độ chính xác:
Độ lặp lại: Tiến hành xác định hàm lượng của một mẫu CBQ đã trộn đồng nhất bằng phương pháp đề xuất ít nhất 6 lần. Các lần thử tiến hành độc lập với nhau. Tính giá trị
trung bình (X ) và độ lệch chuẩn tương đối (RSD%) để đánh giá độ lặp lại.
Độ chính xác trung gian: Là độ chính xác được khảo sát với ít nhất một điều kiện khác nhau: thiết bị, người phân tích, ngày phân tích,… Tiến hành như độ lặp lại trong 3 ngày khác nhau. So sánh 3 kết quả X và RSD% trong 3 ngày để đánh giá độ chính xác trung gian. Áp dụng phép phân tích phương sai một yếu tố để so sánh phương sai của 3 nhĩm kết quả.
Độđúng:Khảo sát độđúng bằng cách thêm vào mẫu CBQ một lượng chất chuẩn rutin bằng 90%, 100% và 110% so với hàm lượng flavonoid tồn phần trong mẫu CBQ. Sau