PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.5. Định lượng Q trong huyết tương
Xây dựng quy trình định lượng Q trong huyết tương
Mẫu máu
− Tách lấy huyết tương − Thủy phân
− Chiết bằng ethyl acetate − Ly tâm
Dịch trong
− Loại bỏ dung mơi dưới dịng khí nitơ − Hịa tan cắn trong MeOH
Sắc ký
Đối chiếu với chất chuẩn Q
Sơđồ 2-2. Sơ đồ quy trình định lượng Q trong huyết tương
Nồng độ Q trong huyết tương người được định lượng bằng phương pháp sắc ký lỏng ghép khối phổ:
− Cột: Gemini C18 NX (150 mm x 4,6 mm; 5 µm).
− Pha động: dung dịch acid formic 0,05% - MeCN (60 : 40). − Nhiệt độ cột: 35 oC.
− Tốc độ dịng: 0,5 mL/ phút. − Thể tích tiêm: 20 µL.
− Chất chuẩn nội: Naringenin. − Phát hiện: Đầu dị khối phổ.
Thẩm định quy trình định lượng Q trong huyết tương
Pha các mẫu thử:
− Mẫu (A): chứa Q và naringenin đối chiếu trong MeOH, nồng độ tương ứng là 25 ng/ mL và 500 ng/ mL.
− Mẫu (B): chứa Q và naringenin đối chiếu trong huyết tương, nồng độ tương ứng là 0,3 ng/ mL và 500 ng/ mL (6 mẫu).
Các mẫu huyết tương được xử lý theo quy trình.
Tính tương thích của hệ thống: Tiêm 6 lần dung dịch mẫu (A). Tính tương thích hệ
thống được khảo sát với các thơng số sắc ký: thời gian lưu (tR), diện tích pic.
Tính đặc hiệu: Khảo sát thời gian lưu và phổ đồ trên mẫu huyết tương cĩ chứa Q và chất chuẩn nội. Tiêu chuẩn: trên sắc ký đồ mẫu chuẩn và mẫu thử, pic của Q và chất chuẩn nội tách rõ so với các pic khác.
Độ tuyến tính: Tương quan giữa diện tích pic và nồng độđược xây dựng trên 9 nồng
độ khác nhau trong khoảng nồng độ khảo sát. Xác định bằng phương pháp hồi quy tuyến tính.
Giới hạn định lượng:Ở nồng độ Q trong huyết tương thấp nhất mà các kết quả sau khi phân tích đạt độ chính xác và độ đúng theo quy định thì được chấp nhận là giới hạn
định lượng dưới của phương pháp.
Độ đúng và độ chính xác: Tiến hành khảo sát độ đúng, độ chính xác trong ngày và giữa các ngày. Pha 3 lơ mẫu chứa Q đối chiếu trong huyết tương ở 4 nồng độ LLOQ, LQC, MQC, HQC tương ứng 0,3; 1,0; 25,0 và 40,0 ng/ mL. Một lơ xử lý mẫu và phân tích ngay, 2 lơ cịn lại bảo quản ở nhiệt độ -80 0C, phân tích vào 2 ngày tiếp theo.
− LLOQ: giới hạn định lượng dưới. − LQC: mẫu kiểm chứng ở nồng độ thấp.
− MQC: mẫu kiểm chứng ở nồng độ giữa. − HQC: mẫu kiểm chứng ở nồng độ cao.
Hiệu suất chiết: Chuẩn bị các mẫu Q đối chiếu trong huyết tương và trong dung mơi pha mẫu ở các nồng độ LQC, MQC, HQC tương ứng 1,0; 25,0 và 40,0 ng/ mL. Tiến hành xử lý mẫu theo quy trình.
Độ ổn định của dung dịch chuẩn gốc (bảo quản ở -200C): Pha 3 lơ mẫu chứa Q và Naringenin đối chiếu trong dung mơi pha mẫu, mỗi lơ 6 mẫu ở các nồng độ 25,0 ng/ mL, Phân tích ngay 1 lơ theo phương pháp đã xây dựng. Các lơ cịn lại bảo quản ở
nhiệt độ -200C trong các khoảng thời gian sau 15 ngày, 30 ngày.
Độổn định của hoạt chất trong huyết tương
Độổn định đơng - rã đơng: Pha 2 lơ mẫu chứa Q đối chiếu trong huyết tương, mỗi lơ 6 mẫu ở các nồng độ 1,0 ng/ mL; 40,0 ng/ mL. Phân tích ngay 1 lơ theo phương pháp
đã xây dựng, lơ cịn lại bảo quản ở -800C, lấy ra để ở nhiệt độ phịng cho đến khi rã
đơng, lặp lại chu trình thêm 2 lần. Sau 3 chu trình đơng - rã đơng, xử lý mẫu, phân tích mẫu theo phương pháp đã xây dựng.
Độổn định sau 16 giờ xử lý mẫu bảo quản trong buồng tiêm mẫu ở 150C: Tiêm lại lơ mẫu ở nồng độ 1,0 ng/ mL và 40,0 ng/ mL, mỗi lơ 6 mẫu, sau 16 giờ xử lý và bảo quản trong buồng tiêm mẫu ở 150C.
Độ ổn định dài hạn bảo quản ở -800C: Pha 4 lơ mẫu chứa Q đối chiếu trong huyết tương, mỗi lơ 6 mẫu ở các nồng độ 1,0 ng/ mL và 40, ng/ mL. Phân tích ngay 1 lơ theo phương pháp đã xây dựng. Các lơ cịn lại bảo quản ở nhiệt độ -800C trong các khoảng thời gian sau 15 ngày, sau 30 ngày.