a. Sản xuất ống thạch:
Sản xuất giống ống thạch là khâu đầu tiên của cơng tác giống vì vậy phải hết sức thận trọng, mọi cơng việc đều phải tiến hành trong điều kiện vơ trùng để giống khơng bị tạp nhiễm. Mơi trường nuơi cấy cĩ nhiều loại, mơi trường tiêu biểu cĩ thành phần như sau:
Thạch 18–20g
Đường 20g
Nước giá đậu 1000ml
Cách làm:
- Rửa sạch 300g giá đậu cho vào 1000ml nước, đun sơi nửa giờ, chắt lấy nước, bổ sung thêm nước cho đủ 1000ml, cho thạch và đường vào đun sơi, lọc, lại đun sơi tiệt trùng lần nữa, điều chỉnh pH mơi trường đạt 4.5–5.0 bằng acid citric hoặc acid acetic.
- Trường hợp nếu khơng cĩ giá đậu cĩ thể lấy hạt đậu nành, ngâm vào nước từ 6–8 giờ, tùy theo thời tiết khác nhau. Rửa sạch gạn bỏ nước, cho nước mới vào theo tỷ lệ một đậu bốn nước, đun 3–4 giờ, chắt lấy nước. Thường 100g đậu lấy được 200ml dung dịch. Cứ 1000ml dung dịch lại cho thêm 25–30g thạch và 4% đường maltose, lọc qua vải màn ta được mơi trường.
- Trước khi phân phối mơi trường vào các ống nghiệm, ống nghiệm phải được cọ sạch, thanh trùng, đậy nút bơng, sấy ở nhiệt độ 100oC trong 1 giờ. Mơi trường chứa trong mỗi ống nghiệm chỉ được bằng 1/5 dung tích của nĩ, khơng để dính mơi trường vào miệng ống dễ gây nhiễm. Sau khi phân phối xong đậy nút bơng, lấy giấy dầu bịt kín đầu ống nghiệm, đưa vào thanh trùng ở áp lực 1,2 kg/cm2
trong 1 giờ. Nếu khơng cĩ nồi hấp áp lực thì dùng phương pháp thanh trùng gián đoạn (hấp cách thủy 1giờ lấy ra để trong tủ ấm 28–30°C trong một ngày rồi lại hấp tiếp đủ 3 lần). Sau lần hấp cuối cùng đặt nghiêng ống nghiệm để tạo thành ống mơi trường cĩ mặt nghiêng, rồi đặt vào tủ ấm 28–30°C giữ 3 ngày. Kiểm tra lại khơng thấy cĩ khuẩn lạc xuất hiện mới cấy giống. Dùng que cấy giống, nuơi ở nhiệt độ 28–30°C trong 4–5 ngày khi thấy mốc cĩ màu hung là được, vì lúc này mốc ở thời kỳ cĩ đủ bào tử. Giống ống thạch chỉ nên dùng qua 7 thế hệ, sau đĩ phải thay giống gốc mới.
b.Sản xuất mốc giống trung gian:
Giống trung gian là loại giống đã được nhân từ ống thạch ra, sử dụng trực tiếp cấy vào nguyên liệu sản xuất. Cĩ 2 cách nuơi giống trung gian: nuơi trong bình tam giác và nuơi trong hộp nhơm.
Nuơi giống trong bình tam giác:
- Đối với những xưởng sản xuất qui mơ nhỏ (500–1000kg chao/ngày) cĩ thể dùng bình tam giác cỡ 1 lít để nhân giống trung gian. Thành phần mơi trường:
Bã đậu phụ 1kg Bột mì 0.5kg
- Các nguyên liệu này được phối hợp với nước để cho mơi trường cĩ hàm ẩm 70–72%, pH của mơi trường được điều chỉnh 5.5–6.0 bằng acid citric hoặc acid acetic.
- Mơi trường phân phối vào mỗi bình tam giác từ 50–60g, đậy nút bơng, dùng giấy bạc hoặc giấy dầu bịt kín miệng, hấp ở áp lực 1,2 kg/cm2 trong 45 phút (nếu hấp ở áp lực thường phải 2 giờ). Mơi trường sau khi hấp xong cĩ màu nâu nhạt là tốt, đậm quá là hỏng vì protid đã bị biến tính là do mơi trường quá acid, thời gian hấp quá dài, áp lực hấp quá cao, nhiệt độ hấp quá lớn. Hoặc cĩ trường hợp mơi trường sau khi hấp xong bị vĩn cục do hàm ẩm quá cao hoặc quá thấp. Mơi trường sau khi hấp xong phải lắc ngay để nguyên liệu trong bình cĩ đủ độ tơi và xốp giúp cho mốc phát triển tốt. Khi mơi trường nguội đến 30–35°C, cấy giống ống thạch vào. Nuơi ở nhiệt độ 28–30°C khoảng 18–24 giờ sau, ta thấy xuất hiện các khuẩn ty ngắn màu trắng, 3–4 ngày sau các khuẩn ty phát triển dài đến 3–4cm.
Nuơi trong các hộp bằng nhơm:
- Ở những xuởng sản xuất qui mơ lớn (1 tấn/ngày trở lên), phải dùng các hộp nhơm để nhân giống trung gian. Hộp nhơm cĩ kích thước phù hợp là loại cĩ đường kính 30cm, cao 12cm, cĩ nắp đậy vừa khít, đặt trong các phịng tương đối vơ trùng để nuơi. Thành phần mơi trường cũng như đối với bình tam giác nhưng hàm ẩm phải thấp hơn 60–67% nếu hấp trong điều kiện thủ cơng, 62–67% trong điều kiện áp lực cao để sau khi hấp xong mơi trường cĩ hàm ẩm 70% phù hợp với yêu cầu phát triển của nấm mốc. Phương pháp hấp cũng như nuơi tiến hành giống như nuơi trong bình tam giác, tuy nhiên thời gian nuơi ngắn hơn chỉ khoảng 48–56 giờ là được.
c.Sản xuất mốc bột bào tử:
Mốc giống trung gian cho vào bột mì đã rang chín vàng với tỉ lệ 1:1, dùng tay sạch bĩp thật nhỏ mơi trường để các bào tử trên khuẩn ty quyện lẫn vào bột, rây lấy bột ta cĩ mốc bột bào tử. Khi chưa dùng, đem bột sấy ở nhiệt độ 40oC trong 4 giờ, đĩng vào các túi P.P hai lớp, bảo quản ở nhiệt độ 0–3oC, sử dụng dần trong 7–8 ngày.
Hình 5.4: Qui trình sản xuất giống vi sinh vật Giá đậu Nước Đun sôi Lọc Nước đậu Đun sôi Hấp Ống môi trường Cấy giống Nuôi mốc giống Ống giống Bã đậu+bột mì+nước Trộn đều
Phân phối vào hộp nhôm hoặc bình tam giác Hấp Cấy giống Nuôi Trộn Rây Bột mì rang chín Bã