- EMEM 5%FCS PBS
2.3.4 Phương pháp ELISA
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 36
T1: Coating buffer: Bicarbonate/carbonate buffer (SIGMA 21851-50EA-F) (Pha loãng 1 viên ựông khô trong 100ml nước cất ựể ựược dung dịch 0.05M có pH = 9.6 giữ ở nhiệt ựộ phòng)
T2: PBS-T: 0.5% Tween 20 trong PBS T3: Blocking buffer: 10%FCS trong PBS-T
T4: Conjugate: Rabbit anti-pig IgG PO conjugate (kháng thể này ựược chế trên thỏ -Nhập ngoại) (SIGMA A5670) pha loãng với PBS -T
T5: Substrate: TMB chất nền hệ thống chất lỏng của hãng SIGMA (SIGMA T0440-100ml)
T6: Chất dừng phản ứng: 1M H2SO4. (100ml = 93ml nước cất + 7ml H2SO4)
* Các bước thực hiện phản ứng ELISA
Bảng 2.6. Các bước thực hiện phản ứng ELISA Bước làm Thực hiện
Cốt kháng nguyên chế
ựược
1. Pha loãng kháng nguyên dương tắnh và kháng nguyên âm tắnh ựã chế ựược pha 1/400 trong dung dịch ựệm Coating buffer (T1).
2. Nhỏ 50 ộl của kháng nguyên pha loãng vào mỗi giếng của ựĩa ELISA.
0
.
Rửa lần 1 Rửa ựĩa 3 lần với lượng 300ộl của PBS (T2)/1 giếng .
Nhỏ mẫu huyết thanh
kiểm tra
4. Pha loãng mẫu huyết thanh kiểm tra trong dung dịch ựệm blocking buffer (T3).
5. Nhỏ 50ộl của dung dịch pha loãng mẫu kiểm tra vào mỗi giếng.
6. Ủ 37oC trong 30 phút.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 37
Nhỏ conjugate
7. Pha loãng anti-Pig IgG PO conjugate (T4) 1/1000 trong PBS (T2)
8. Nhỏ 50ộl conjugate ựã pha loãng vào mỗi giếng. 9. ủ 37oC trong 30 phút.
Rửa lần 3 Rửa ựĩa 3 lần với lượng 300ộl của PBS (T2)/1 giếng .
Nhỏ cơ chất 10.Nhỏ 50ộl dung dịch Substrate (T5) vào mỗi giếng. 14. Ủ nhiệt ựộ phòng 20 phút
Dừng phản ứng và ựọc
kết quả
Nhỏ 50ộl dung dịch dừng phản ứng (T6).
đọc kết quả bằng máy ELISA ở bước sóng 650 nm.
Hình 2.1. Mô tả phản ứng ELISA gián tiếp phát hiện kháng thể PRRS