- EMEM 5%FCS PBS
2.3.2 Phương pháp phát hiện, giám ựịnh vi rút bằng phương pháp realtime RT-PCR
2.3.2 Phương pháp phát hiện, giám ựịnh vi rút bằng phương pháp realtime RT-PCR RT-PCR Chuẩn bị: Kắt chiết tách RNA Kắt nhân gen đầu tắp 1000ộl, 200ộl có ựầu lọc Xử lý bệnh phẩm:
+ Các phủ tạng ựược nghiền trong cối chày sứ vô trùng, pha thành huyễn dịch 1:10 với nước sinh lý (hoặc PBS pH 7.2) có kháng sinh (Penicillin
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 30
2000UI/ml, Streptomycin 2mg/ml). Ly tâm lấy dịch nổi ựể chiết tách RNA. + Mẫu là huyễn dịch sau khi phân lập có bệnh tắch tế bào trên tế bào MARC 145.
Tiến hành:
Chiết tách RNA: Các mẫu bệnh phẩm nên chiết tách bằng kắt, khi sử dụng nên theo hướng dẫn của nhà sản xuất (có thể sử dụng bộ kắt Qiagen Rneasy Extraction cat # 74104 50 prep hoặc # 74106 250 prep)
Ớ Nhỏ 500ộl huyễn dịch phủ tạng vào ống ly tâm loại 1,5 ml cộng với 500ộl Qiagen buffer RLT có 1% β-ME, lắc ựều trên máy Votex
Ớ Ly tâm nhẹ rồi thêm 500ộl cồn ETOH 70% (ethanol) vào ống, lắc mạnh bằng máy Votex
Ớ Ly tâm mẫu ựã bị dung giải trong 5 phút ở tốc ựộ 5000xg ở nhiệt ựộ phòng;
Ớ Chuyển tất cả dịch nổi sang cột lọc RNeasy Qiagen, ly tâm trong 15 giây tốc ựộ ≥ 8000xg ở nhiệt ựộ phòng;
Ớ Bổ sung 700ộl dung dịch rửa 1 (RW1 buffer) vào cột RNeasy Qiagen, ly tâm trong 15 giây ở tốc ựộ ≥ 8000xg, thay ống thu mới vào cột lọc;
Ớ Nhỏ 500ộl dung dịch rửa RPE buffer vào cột RNeasy và ly tâm trong 15 giây ở tốc ựộ ≥ 8000xg, thay ống thu mới, lặp lại 2 lần với dung dịch rửa RPE buffer, thay ống thu mới;
Ớ Ly tâm cột lọc và ống thu trong 2 phút ở tốc ựộ tối ựa, bỏ ống thu;
Ớ đặt cột lọc vào ống thu RNA, nhỏ 50ộl RNase free H2O vào cột lọc, ủ ở nhiệt ựộ phòng trong ắt nhất 1 phút. Tách RNA bằng cách ly tâm trong 1 phút ở 10000vòng/phút, bỏ cột lọc, giữ lại dịch trong ống thu RNA;
Ớ Bảo quản mẫu RNA thu ựược ở 40C trong thời gian ngắn trước khi làm RRT-PCR, nếu sau 24 giờ, mẫu nên bảo quản ở - 200C hoặc nhiệt ựộ thấp
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 31
hơn.
Tiến hành phản ứng RRT-PCR:
Danh sách các cặp mồi sử dụng cho phản ứng realtime RT-PCR trong phát hiện vi rút PRRS thuộc các dòng Bắc Mỹ, Châu Âu và Việt Nam.
Bảng 2.1. Danhmục các cặp mồi và mẫu dò
đầu gắn huỳnh quang Tên Cặp mồi/
Mẫu dò Trình tự gen(5'-3')
5' 3'
Mẫu dò TGT GGT GAA TGG CAC TGA TTG ACA FAM BHQ1
Mồi xuôi ATG ATG RGC TGG CAT TCT Không Không PRRS-1
(NA)
Mồi ngược ACA CGG TCG CCC TAA TTG Không Không
Mẫu dò CCT CTG CTT GCA ATC GAT CCA GAC FAM BHQ1
Mồi xuôi GCA CCA CCT CAC CCA GAC Không Không PRRS-2
(EU)
Mồi ngược CAG TTC CTG CGC CTT GAT Không Không
Mẫu dò CGCGTAGAACTGTGACAACAACGCTGA HEX BHQ1
Mồi xuôi CCCAAGCTGATGACACCTTTG Không Không PRRS-
China (JVM)
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 32
CHÚ THÍCH:
PRRS-1 (NA) dùng ựể phát hiện vi rút PRRS dòng Bắc Mỹ PRRS-2 (EU) dùng ựể phát hiện vi rút PRRS dòng châu Âu
PRRS-China dùng ựể phát hiện vi rút PRRS gây nên dịch PRRS ở Việt Nam
- Công thức pha: Công thức này có thể thay ựổi cho phù hợp với từng loại primer và từng loại kắt realtime RT-PCR khác nhau. (Với hãng Invitrogen có công thức pha)
Bảng 2.2. Công thức áp dụng cho kắt realtime RT-PCR Hỗn hợp phản ứng Lượng dùng H2O 5,5 ộl 2X Reaction buffer 12,5 ộl Enzyme mix 0,5 ộl Primer forward 0,5 ộl Primer reverse 0,5 ộl Probe 0,5 ộl Mẫu RNA 5 ộl Tổng cộng 25 ộộộộl - Tiến hành phản ứng:
đặt ống phản ứng vào máy chu kỳ nhiệt và chọn chương trình chạy PCR bằng phần mềm trên máy vi tắnh. Nhập ký hiệu mẫu kiểm tra cùng với mẫu ựối chứng dương tắnh, âm tắnh vào phần ký hiệu mẫu trong bảng kết quả. Lưu chương trình chạy máy. Cài ựặt chương trình phân tắch dữ liệu cho máy chu kỳ nhiệt Cepheid Smart Cycler hoặc Biorad IQ5 và chạy chương trình.
Bảng 2.3. Chu kì nhiệt của phản ứng realtime RT-PCR
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 33 50 15 phút RT 95 2 phút 1 95 10 giây Invitrogen superscript 3 PCR 58 50 giây 40 - Phân tắch kết quả xét nghiệm:
Kết quả chạy realtime RT - PCR ựược xác ựịnh dựa vào chu kỳ ngưỡng (Ct) phát hiện tắn hiệu huỳnh quang.
- Mẫu ựược coi là dương tắnh khi có Ct ≤ 35 - Mẫu ựược coi là âm tắnh nếu không có Ct - Mẫu ựược coi là nghi ngờ nếu Ct >35.