- EMEM 5%FCS PBS
3.2 Chế kháng nguyên cho kắt ELISA
Khi ựã có kết quả chuẩn ựộ của vi rút chúng tôi tiến hành chế kháng nguyên, sử dụng 20 chai tế bào MARC 145 dung tắch 75cm2 (T75) với lượng tế bào ựưa vào trong mỗi chai là 1x106TB/1T75, nuôi trong 3 ngày khi tế bào ựạt khoảng 80-90% thì nhiễm vi rút với liều 500TCID50 của vi rút PRRS 07196 108,2TCID50 cho 10 chai, 10 chai còn lại không nhiễm chỉ thay môi trường. Nuôi tiếp 20 chai trong 7 ngày khi tế bào phá hủy 100%, chiết tách lấy protien của vi rút làm kháng nguyên cho phản ứng ELISA bằng dung dịch RIPA (Radio-Immunoprecipitation Assay) chứa NP-40 Dưới ựây là một số hình ảnh về quá trình tách chiết protein vi rút.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 46
Hình 3.1. Hình ảnh 10 chai tế bào trước khi nhiễm
Sau khi gây nhiễm và nuôi trong tủ ấm 370C có 5%CO2, theo dõi hàng ngày sự phát của vi rút qua hình thái biểu hiện bằng bệnh tắch tế bào (CPE).
Hình 3.2. Hình ảnh tế bào bình thường Hình 3.3. Hình ảnh tế bào phá hủy 100%
10 chai tế bào gây nhiễm (kháng nguyên dương tắnh) có 100% CPE tức là tế bào MARC 145 bị pha hủy 100%, 10 chai không gây nhiễm (kháng nguyên âm tắnh). Thu toàn bộ lượng tế bào trong 10 chia riêng biệt và dùng RIPA với lượng ựưa vào chiết tách Protein vi rút là 1ml/ lượng tế bào của 1 chai T75. Lắc tế bào và RIPA trong 15 phút và các bước ủ 40C qua ựêm.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 47
Hình 3.4. Xử lý RIPA trên chai tế bào bị phá hủy
Hình 3.5. Ảnh chiết tách protein vi rút bằng RIPA
Ngày hôm sau tiến hành các bước tiếp theo là ly tâm và thu kháng nguyên. Kháng nguyên dương tắnh và âm tắnh thu ựược mỗi loại là 10ml, tiến hành tinh sạch và chia nhỏ ra ống CryotubeTM với lượng trong mỗi ống là 500ộl, bảo quản 40 ống kháng nguyên trong tủ âm 800C.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 48