- EMEM 5%FCS PBS
3.3.1Kết quả chuẩn ựộ kháng nguyên bằng phản ứng IPMA
Kháng nguyên là dạng vi rút sống dùng phương pháp IPMA ựể chuẩn ựoán lượng kháng nguyên ựưa vào trong phản ứng, ựối với phương pháp IPMA quá trình thực hiện qua hai bước chắnh, bước ựầu là nuôi và gây nhiễm vi rút tế bào lượng vi rút ựưa vào gây nhiễm trên ựĩa phản ứng là lượng kháng nguyên ổn ựịnh ựã ựược xác ựịnh liều và chuẩn ựộ trước ựó ựể có ựược bệnh tắch tế bào(CPE) và xác ựịnh ựược thời ựiểm làm phản ứng miễn dịch. Bước thứ 2 là tạo miễn dịch với kháng huyết thanh chuẩn và kháng huyết thanh kiểm tra sau ựó gắn enzym peroxydase, khi phản ứng kết thúc kháng nguyên và kháng thể dương tắnh ựặc hiệu thì trong tế bào phần nguyên sinh chất bắt màu ựỏ ựậm. Chúng tôi tiến hành chuẩn ựộ kháng nguyên tự chế pha loãng theo các nồng ựộ 100->800TCID50 và theo dõi sự phát triểu CPE trên tế bào 1 lớp MARC. Kết quả thể hiện ở bảng 3.2.
Bảng 3.2. Kết quả theo dõi sự phát triển bệnh tắch tế bào sau 3 ngày
Kháng nguyên pha loãng liều
TCID50
sau 24 giờ sau 48 giờ sau 72 giờ
đánh giá mức ựộ bề mặt thảm sau 72 giờ
gây nhiễm
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 49 200 - + + 20% 300 - + + 20% 400 - + ++ 40% 500 + ++ +++ 80% 600 + +++ +++ 80% 700 ++ +++ ++++ 100% 800 ++ ++++ ++++ 100%
Ghi chú: - : Không có CPE
+ : Thảm tế bào có 10->20% CPE ++ : Thảm tế bào có 40->50% CPE +++ : Thảm tế bào có 80->90%CPE ++++ : Thảm tế bào có 100% CPE
đánh giá mức ựộ CPE chúng tôi sử dụng kắnh hiển vi ựảo ngược ựể quan sát mật ựộ CPE trên một vi trường và trung bình cộng của cả mặt thảm tế bào gây nhiễm vi rút. đối với phản ứng IPMA thời ựiểm xác ựịnh CPE ựể dừng quá trình phát triển và làm phản ứng tiếp theo ựóng vai trò quan trọng vì nếu mật ựộ CPE quá ắt hay nhiều thì khi kết quả phản ứng miễn dịch sẽ rất khó kết luận.
Theo kết quả chuẩn ựộ ở bảng 2 cho thấy sau 72 giờ nuôi cấy tế bào gây nhiễm vi rút thì nồng ựộ vi rút là 100-> 400TCID50 mật ựộ CPE quá ắt, như vậy khi có kháng thể sẽ không ựánh giá hết ựược hàm lượng kháng thể ựưa vào phản ứng. Ở nồng ựộ vi rút từ 600 ựến 800 lúc này do vi rút ựưa vào nhiều do ựó CPE hình thành cũng rất nhanh lúc này CPE có nhiều nhưng hàm lượng vi rút nhân lên không nhiều do gây bệnh tắch cấp tắnh. Với nồng ựộ vi rút là 500TCID50 sau 72 giờ nuôi cấy CPE hình thành là 80% bề mặt thảm ở nồng ựộ này chúng tôi ựã chọn làm kháng nguyên cho các phản ứng IPMA
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 50
chuẩn ựoán huyết thanh bệnh PRRS. để kiểm tra tắnh ổn ựịnh của nồng ựộ vi rút là 500TCID50 chúng tôi ựã tiến hành thử nghiệm lặp lại nồng ựộ này 5 lần kết quả cho thấy trong 5 lần thử nghiệm ựều có kết quả giống nhau sau 72 giờ thì CPE ựạt 80% bề mặt thảm. Sau ựó chúng tôi ựã làm bước 2 là gắn kháng thể chuẩn PRRS, enzym và chất phát màu, hình ảnh ựặc trưng của IPMA.
Dưới ựây là hình ảnh bệnh tắch tế bào (CPE) trên tế bào MARC 145, hình 3.6 là hình ảnh dương tắnh với phản ứng IPMA, các tế bào bị vi rút xâm nhập và gây bệnh khi có kháng thể ựặc hiệu kết hợp thì trong nguyên sinh chất của tế bào ựó bắt màu ựỏ ựậm rất ựặc trưng. Các tế bào bị sâm nhâp gây bệnh, khi huyết thanh gây miễn dịch không ựặc hiệu thì nguyên sinh chất không bắt màu tức là huyết thanh âm tắnh hình 3.7.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 51
Hình 3.7. Hình ảnh âm tắnh trong phản ứng IPMA
Như vậy kết quả chuẩn ựộ kháng nguyên sau 72 giờ gây nhiễm với liều 500TCID50 cho thấy bệnh tắch trên tế bào rõ ràng và khi làm phản ứng IPMA cho kết quả tốt, ựảm bảo kết quả về mặt hình thái khi quan sát trên kắnh hiển vi ựảo ngược.