- EMEM 5%FCS PBS
2.3.3 Phương pháp chế kháng nguyên và kháng huyết thanh
* Chế kháng nguyên dương tắnh và âm tắnh cho phản ứng ELISA
Bảng 2.4. Các bước tiến hành chế kháng nguyên cho phản ứng ELISA Các bước Tiến hành
Nuôi cấy và thu hoạch tế bào
1. Sử dụng 10 chai 75cm tế bào MARC 145.
2. Nhiễm vi rút PRRS ựã chọn liều 500TCID50/1chai vào 10 chai tế bào ựã có 80% mặt thảm.
3. Khi 10 chai tế bào ựã có CPE (++++) (Tế bào ựã chết 100%), thu tất cả huyễn dịch chứa vi rút trong 10 chai vào ống falcon 50ml.
4. Ly tâm 3000 vòng 30 phút ở 40C.
Rửa tế bào
5. Bỏ môi trường ở trên giữ cặn tế bào
6. Nhỏ 10ml PBS vào cặn tế bào, ựánh tan tế bào bằng pipet. 7. Chuyển tất cả vào ống falcon 15ml.
8. Ly tâm với tốc ựộ 3000/15 phút, Bỏ môi trường ở trên.
Bóc tách màng tế
bào
9. Nhỏ 10ml dung dịch RIPA (Radio-Immunoprecipitation Assay) chứa NP-40, lắc mạnh bằng máy vortex trong vòng 10 phút.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 34 (24giờ). Thu hoạch KN dương tắnh và âm tắnh
11. Từ ống falcon 15 chứa 10ml huyễn dịch ựã ủ qua ựêm 12. Ly tâm huyễn dịch với tốc ựộ 14.000g trong vòng 30 phút. 13. Thu huyễn dịch kháng nguyên ở trên.
14. Chia nhỏ ra các ống CryotuberTM Vials, lưu tủ ở - 800C. Sử dụng làm kháng nguyên dương tắnh và âm tắnh.
Chuẩn bị KN âm
14.Chuẩn bị kháng nguyên âm tắnh không nhiễm vi rút mà chỉ có tế bào MARC và môi trường.
Ghi chú: Dung dịch ựệm RIPA (Radio-Immunoprecipitation Assay) chứa NP- 40: [25mM Tris-HCl dung dịch ựệm pH7.6, 150mM NaCl, 1% NP-40]
- Pha 100ml RIPA (Radio-Immunoprecipitation Assay) chứa NP-40 Lysis buffer: (Nhỏ 2.5ml của 1M Tris-HCl buffer, 3ml của 5M NaCl, và 1ml của NP-40 trong 93.5ml nước cất).
* Chế kháng nguyên chuẩn cho phản ứng IPMA
Chuẩn bị:
- Vi rút PRRS ựã chuẩn ựộ
- 10 chai tế bào MARC 145 ựã phủ 80% bề mặt thảm. - đầu týp vô trùng các loại
- PBS vô trùng
- Ống fancol 15ml, 50ml - Ống CryotuberTM Vials
Bảng 2.5. Các bước chế kháng nguyên cho phản ứng IPMA, FAT Các bước Tiến hành
Tiến hành
1. Chuẩn bị 5 chai 75cm tế bào MARC 145.
2. Nhiễm vi rút PRRS ựã chọn liều chuẩn ựộ TCID50/1chai vào 5 chai tế bào ựã có 80% mặt thảm .
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 35
4. đông tan 3 lần (cho 5 chai tế bào trên vào tủ - 800C sau 1 giờ bỏ ra nhiệt ựộ phòng ựể cho tan hết sau ựó lại cho vào tủ - 800C lặp lai 3 lần)
5. Thu tất cả huyễn dịch chứa vi rút trong 5 chai vào ống falcon 50ml.
6. Ly tâm 3000 vòng 30 phút ở 40C. Thu hoạch
vi rút
7. Thu môi trường ở trên bỏ cặn tế bào.
8. Chia nhỏ ra các ống CryotuberTM Vials, lưu tủ ở - 800C.
Ghi chú: Các thao tác kỹ thuật phải thực hiện trong buồng cấy vô trùng
* Phương pháp chế kháng huyết thanh
Chuẩn bị: - Sử dụng 3 lợn 4-5 tuần tuổi khỏe mạnh chưa tiêm vắc xin - Vi rút ựã chọn chuẩn ựộ liều 105 TCID50.
Tiến hành:
- Tiêm 0.2ml vắc xin nhược ựộc PRRS vào 3 lợn, nuôi tiếp 3 tuần.
- Gây nhiễm vi rút ựã chọn cho 3 lợn: Nhỏ vi rút vào mũi lợn mỗi con 1ml liều 106TCID50.
- Kiểm tra kháng thể kháng vi rút PRRS hàng tuần ựến khi thấy hàm lượng kháng thể cao và ổn ựịnh.
- Thu hoạch kháng huyết thanh: Lấy máu tĩnh mạch cổ. - Ly tâm máu, chắt huyết thanh.
- Chia nhỏ kháng huyết thanh chế ựược ghi lô và ngày chế.
- Chuẩn ựộ kháng thuyết thanh chế ựược bằng phương pháp ELISA - Chuẩn ựộ kháng thuyết thanh chế ựược bằng phương pháp IPMA - Sử dụng kháng huyết thanh chế ựược trong phản ứng ELISA, IPMA.