- EMEM 5%FCS PBS
2.3.5 Phương pháp IPMA
* Nguyên tắc: đây là phương pháp sử dụng thảm tế bào 1 lớp ựã gây nhiễm vi rút chuẩn ựể phát hiện kháng thể nghi. Nếu huyết thanh có kháng thể thì có sự
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 38
kết hợp của kháng nguyên, kháng thể và kháng kháng thể, khi cho cơ chất vào sẽ xuất hiện màu ựỏ ựậm, ựó là phản ứng dương tắnh. Phản ứng âm tắnh nếu thảm tế bào có màu hồng nhạt không có sự kết hợp của kháng nguyên và kháng thể.
* Chuẩn bị
- Môi trường phát triển tế bào MEM với 5% FCS - Tế bào MARC 145.
- Giống vi rút chuẩn PRRS. - Kháng huyết thanh kiểm tra
- Dung dịch A: dung dịch cố ựịnh tế bào, gồm: PBS có 10% formalin và 1% NP40.
- Dung dịch B: dung dịch nước rửa, gồm PBS với 1 % Tween 20.
- Dung dịch C: dung dịch pha loãng mẫu bao gồm PBS 1% Tween 20 và 10%FCS.
- Dung dịch E: dung dịch AEC, gồm 1 ml dung dịch AEC nguyên chất + 14 ml dung dịch ựệm axetat 0,1 M (pH 5,2) + 15 ộl H2O2 30 %.
* Cách tiến hành
a) Bước 1: Chuẩn bị tế bào MARC -145 trên ựĩa 96 giếng
- Tế bào MARC-145 ựựng trong ống cryotube ựược ựưa ra khỏi bình nitơ lỏng, nhanh chóng giải ựông rồi cho hỗn hợp tế bào vào ống ly tâm 15 ml có chứa sẵn 10 ml dung dịch MEM 5% FCS. Trộn ựều bằng pipet, cho vào ly tâm ở gia tốc 1500g trong 5 min. Hút bỏ nước trong ở trên, giữ phần cặn ở dưới rồi cho tiếp vào 5ml dung dịch MEM 5% FCS, trộn ựều bằng pipet. Hút chuyển dung dịch này vào chai nuôi cấy 25cm2. đem nuôi cấy trong tủ ấm 370C có 5% CO2, sau 24 giờ ựưa ra quan sát dưới kắnh hiển vi soi ngược, xem sự phát triển của tế bào. Sau 2 ngày ựến 4 ngày sẽ thu ựược một thảm tế bào. Thu tế bào khi nó ựã phát triển trên 90% diện tắch chai nuôi cấy.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 39
- Thu hoạch tế bào MARC-145 rồi tiến hành pha loãng tế bào với môi trường MEM có 5% FCS với số lượng cần thiết (1x 106tế bào/ml), sau ựó chia ựều vào ựĩa 96 giếng với lượng 100 ộl/giếng.
- Ủ ựĩa tế bào trong tủ ấm 370C có 5%CO2 và nuôi từ 1 ngày ựến 2 ngày cho ựến khi tế bào trong các giếng phát triển thành một lớp 80% bề mặt thảm. b) Bước 2: Gây nhiễm tế bào với vi rút PRRS
- Lấy giống vi rút chuẩn từ nơi bảo quản, làm tan ựá nhanh rồi pha loãng với môi trường MEM có 5% FCS ựể ựược liều 500 TCID50 vi rút/1ml (giống vi rút ựã ựược chuẩn ựộ hiệu giá trước).
- Cho 100 ộl dung dịch vi rút ựã pha loãng ở trên vào mỗi giếng. - Ủ ựĩa trong tủ ấm 370C trong 2 ngày.
c) Bước 3: Cố ựịnh tế bào ựã nhiễm vi rút - Bỏ dung dịch nuôi dưỡng tế bào trong ựĩa. - Cho 100 ộl dung dịch A vào mỗi giếng. - Ủ ở nhiệt ựộ phòng khoảng 30 phút
- Bỏ dung dịch A, rồi rửa ựĩa 2 lần bằng dung dịch rửa B. d) Bước 4: Cho huyết thanh cần kiểm tra
- đối với phản ứng ựịnh tắnh thì chỉ pha loãng huyết thanh ở mức 1/160. - đối với phản ứng ựịnh lượng pha huyết thanh theo cơ số 4 bắt ựầu từ 1/10. - Cho 50 ộl huyết thanh cần kiểm tra ựã pha loãng vào các giếng tương ứng. - Ủ ựĩa ở 370C trong 30 phút.
- Bỏ dung dịch trong ựĩa, rồi rửa ựĩa 3 lần bằng dung dịch B.
e) Bước 5: Cho conjugate: Kháng kháng thể PRRS có gắn enzyme Ờ (Rabbit anti-pig IgG PO conjugate) (kháng thể này ựược chế trên thỏ -Nhập ngoại) - Pha loãng kháng kháng thể với dung dịch pha loãng (dung dịch nước rửa B) theo tỷ lệ 1/1000.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 40
- Ủ ựĩa ở 370C trong 30 phút.
- Bỏ dung dịch trong ựĩa, rồi rửa ựĩa 3 lần bằng dung dịch rửa B. f) Bước 6: Cho cơ chất
- Cho vào mỗi giếng 50 ộl dung dịch AEC - dung dịch E. - Ủ ựĩa ở nhiệt ựộ phòng 30 phút.
g) Bước 7: đọc kết quả
để ựọc kết quả, sử dụng kắnh hiển vi ựảo ngược ựể quan sát bằng mặt thường: - Nếu quan sát thấy thảm tế bào trong giếng có những ựám tế bào bắt màu ựỏ ựậm thì mẫu huyết thanh cho vào giếng ựó dương tắnh kháng thể PRRS. - Nếu quan sát thảm tế bào trong giếng thấy toàn bộ thảm tế bào có màu hồng nhạt Ờ màu của dung dịch MEM 5% FCS thì mẫu huyết thanh cho vào giếng ựó âm tắnh kháng thể PRRS.