- EMEM 5%FCS PBS
3.3.2Kết quả chuẩn ựộ kháng nguyên trên kắt ELISA
Kháng nguyên PRRS 07196 ở dạng protein vi rút và kháng nguyên âm tắnh ựược gắn trên ựĩa ELISA. Sau khi chế kháng nguyên dương tắnh và âm tắnh, lượng kháng nguyên thu ựược là 20 ống Cryotube TM mỗi ống có 500ộl mỗi loại. Chuẩn ựộ kháng nguyên tiến hành lấy 2 ống trong 20 ống của 2 loại kháng nguyên dương tắnh và âm tắnh pha loãng theo các nồng ựộ 1/50, 1/100, 1/200, 1/400, 1/600, 1/800 và 1/1000, dùng dung dịch coating buffer (carbonate/bicarbonate) cốt kháng nguyên lên ựĩa ELISA, kháng thể chuẩn ựược dùng trong phản ứng là kháng thể ựối chứng của kắt Herdcheck 3X, làm phản ứng cùng với dung dịch ựệm và conjugate của kắt.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 52 Kháng thể chuẩn Kháng thể chuẩn Pha loãng S/P dương S/P âm tắnh S/P dương S/P âm tắnh Dương tắnh 2,764 0,778 1,931 0,377 1/50 Âm tắnh 0,833 0,401 Dương tắnh 2,126 0,598 1,486 0,234 1/100 Âm tắnh 0,640 0,365 Dương tắnh 1,519 0,473 0,937 0,142 1/200 Âm tắnh 0,582 0,331 Dương tắnh 1,266 0,350 0,854 0,138 1/400 Âm tắnh 0,412 0,212 Dương tắnh 0,937 0,280 0,621 0,117 1/600 Âm tắnh 0,317 0,163 Dương tắnh 0,625 0,216 0,427 0,114 1/800 Âm tắnh 0,198 0,102 Dương tắnh 0,446 0,166 0,253 0,081 Kháng nguyên 1/1000 Âm tắnh 0,194 0,085
Trong phản chuẩn ựộ kháng nguyên chúng tôi lặp lại 3 lần với cùng ựiều kiện và môi trường làm phản ứng, kết quả ựược tập hợp và phân tắch bằng giá trị S/P trung bình của 3 lần chuẩn ựộ.
Phân tắch kết quả ELISA bằng giá trị S/P có nghĩa là thông qua giá trị OD mà máy ELISA ựọc ựược, công chia trung bình và tắnh theo công thức:
OD mẫu kiểm tra Ờ OD TB của ựối chứng âm
S/P = --- OD TB ựối trứng dương tắnh Ờ OD TB ựối trứng âm tắnh Ghi chú : TB Ờ Trung bình
OD Ờ Giá trị máy ELISA ựọc ựược bằng bước sóng 650 S/P Ờ The sample to positive ratio
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 53
Khi giá trị S/P lớn hơn hoặc bằng 0,4 thì mẫu ựó ựược kết luận là dương tắnh (Kắt herdcheck 3X).
Theo kết quả bảng 3.3 cho thấy các giá trị S/P ở các nồng ựộ pha loãng 1/1000 và 1/800 của kháng nguyên dương tắnh chế ựược có giá trị S/P thấp là 0,253 và 0,427, còn kháng nguyên âm tắnh chế ựược có giá trị S/P ựều thấp hơn ngưỡng 0,4. Như vậy chúng tôi ựánh giá kháng nguyên dương tắnh và âm tắnh chế ựược sử dụng cho phản ứng ELISA là thành công, có thể dùng trong chẩn ựoán huyết thanh học bệnh PRRS bằng phương pháp ELISA. Từ kết quả trên chúng tôi tiến hành ựánh giá xác ựịnh ựộ pha loãng cố ựịnh dùng trong cốt ựĩa sử dụng trong phản ứng ELISA. đánh giá ựược xác ựịnh nồng ựộ pha loãng có giá trị S/P dương tắnh và âm tắnh trung bình của 3 lần chuẩn ựộ ựược tổng hợp tóm tắt ở bảng 3.4.
Từ bảng kết quả chẩn ựoán kháng nguyên kiểm tra với kháng thể chuẩn của kắt Herdcheck 3X chúng tôi thấy ở nồng ựộ kháng nguyên từ 1/50 ựến 1/100 theo kết quả kiểm tra kháng thể chuẩn của kắt Herdchek 3X thì thây hàm lượng kháng nguyên quá cao, giá trị S/P là 1,931 và 1,486 theo ựánh giá kết quả của kắt Herdcheck 3X thì S/P dương tắnh phải lớn hơn hoặc bằng 0,4.
Bảng 3.4. Tóm tắt kết quả S/P của kháng nguyên pha loãng
Kháng nguyên
pha loãng S/P dương tắnh S/P âm tắnh
Chênh lệch giữa S/P (+) và (-) 1/50 1,931 0,377 1,554 1/100 1,486 0,234 1,252 1/200 0,937 0,142 0,795 1/400 0,854 0,138 0,716
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 54
1/600 0,621 0,117 0,504 1/800 0,427 0,114 0,313 1/1000 0,253 0,081 0,172
đối với các ựộ pha loãng 1/600 ựến 1/1000 thì giá trị S/P từ 0,621 ựến 0,253 ở ngưỡng 1/600 tuy giá trị S/P lớn hơn 0,4 nhưng ở ựộ pha loãng này mức ựộ giảm ựột ngột như vậy kháng nguyên sẽ không ổn ựịnh và phản ứng ELISA có nhiều nguy cơ cho kết quả âm tắnh giả. Còn các nồng ựộ tiếp theo có giá trị S/P thấp hơn 0,4 tức là phản ứng âm tắnh. Cũng theo kết quả bảng 3.4, ở ựộ pha loãng và phản ứng chúng tôi thực hiện ựược lặp 3 lần cho thấy kháng nguyên 07196 ựược chấp nhận khi giá trị S/P ựạt 0,854 ựến 0,937 tức là ựộ pha loãng kháng nguyên từ 1/400 -> 1/200 vì giá trị trong ngưỡng này ắt có sự biết ựổi và ổn ựịnh. Ở ựộ pha loãng sau khi trừ S/P kháng nguyên âm tắnh tức là loại trừ các yếu tố ảnh hưởng trong quá trình chế thì giá trị chênh lệch vẫn lớn hơn 0,4. Như vậy ựể ựảm bảo kháng nguyên luôn luôn ổn ựịnh và phản ứng ựược chấp nhận thì thấy có thể dùng ựộ pha loãng là 1/200 ựến 1/400 ựể làm kháng nguyên cho các phản ứng ELISA. Nghiên cứu ựược thể hiện rõ hơn sự biến ựộng của kháng nguyên tự chế bằng hình 3.8.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 55
Hình 3.8. Biểu ựồ hàm lượng kháng nguyên tự chế
để ựảm bảo nồng ựộ tối ưu của kháng nguyên cho phản ứng ELISA, tránh các trường hợp kháng nguyên giảm ựột ngột thì chúng tôi lựa chọn nồng ựộ pha loãng kháng nguyên tự chế là 1/200 cốt cho ựĩa ELISA.