- Các chỉ tiêu ký sinh trùng
3.4.2. Phương pháp xét nghiệm
* Định danh vi khuẩn bằng máy Vitek 2
Máy Vitek là một hệ thống điều khiển bằng bộ vi xử lý điện tử, hoạt động hoàn toàn tựđộng, có khả năng định danh hơn 300 loại vi khuẩn khác nhau và thực hiện các test kháng sinh đồđối với khá nhiều loại kháng sinh.
Hệ thống Vitek có 2 phần chính: modul phần cứng và bộ card chứa hóa chất có sẵn.
- Modul phần cứng gồm bộ phận bơm mẫu, bộ phận đọc và ủ, bộ phận kiểm soát trung tâm, máy so mầu, máy in, nguồn lưu điện.
- Card chứa hoá chất có sẵn, kích thước bằng thẻ tín dụng gồm 30 - 45 khe rất nhỏ phân phối cơ chất để định danh vi khuẩn hoặc kháng sinh làm test kháng sinh đồ. Nguyên lý hoạt động: máy Vitek hoạt động nhờ hệ thống quang học tự động quét quá trình phát triển động học của vi khuẩn. Các phản ứng sinh học xảy ra trong bộ card chứa hóa chất có sẵn sau mỗi giờ. Căn cứ vào hệ thống các phản ứng sinh học, phần mềm của máy tính (computer) phân tích định danh vi khuẩn và ghi lại kết quả.
- Các bước xác định vi khuẩn bằng máy Vitek: Chuẩn bị chủng vi khuẩn. Vi khuẩn cần định danh phải thuần nhất, tức là chọn khuẩn lạc tách biệt trên môi trường agar thích hợp. Vi khuẩn được nuôi cấy trên đĩa thạch 18 đến 24 giờ; nhuộm Gram hoặc thử KOH 0,3% trước khi chọn card định danh cho phù hợp. Nếu vi khuẩn là Gram(+), sử dụng card GPI (Gram Positive Identification); nếu vi khuẩn là Gram(-), sử dụng card GNI (Gram Negative Identification).
- Đánh số card: Với vi khuẩn Gram âm, làm phản ứng oxydaza: nhỏ một giọt nước sinh lý lên phiến kính rồi trộn đều với một khuẩn lạc điển hình. Dùng giấy tẩm oxydaza đặt lên trên hỗn dịch, nếu xuất hiện màu xanh tím là phản ứng dương tính, không chuyển màu là phản ứng âm tính. Trường hợp phản ứng dương tính đánh dấu vào ô O trên card GNI, âm tính thì không đánh dấu ô đó.
+ Với vi khuẩn Gram dương, làm phản ứng catalaza: nhỏ một giọt H2O2 lên phiến kính, lấy một khuẩn lạc điển hình trộn đều. Nếu không thấy hiện tượng gì khác thường thì phản ứng là âm tính, nếu cú hiện tượng sủi bọt (trong thời gian 5 -
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 33 10 phút) là phản ứng dương tính (thời gian vượt quá 10 phút có thể là dương tính giả). Trường hợp phản ứng catalaza dương tính thì đánh dấu vào ô O trên card GPI. Sau đó làm tiếp phản ứng đông huyết tương (coagulaza), phản ứng dương tính, đánh dấu vào ô bầu dục phía dưới. Nếu phản ứng catalaza âm tính để trống ô đó và làm tiếp phản ứng dung huyết β- hemolyzit. Khi phản ứng dung huyết β- hemolyzit dương tính thì đánh dấu vào ô bầu dục ở phía dưới, phản ứng âm tính thì để trống.
- Cách pha hỗn dịch vi khuẩn: Cho vào ống nghiệm 1,8ml dung dịch NaCl 0,85% bằng xi lanh chuẩn hoá. Kiểm tra độ trong suốt của ống nghiệm chứa nước muối trên máy colorimeter, điều chỉnh ở hai mức 0%T và 100%T, sau đú cho vi khuẩn vào ống (tuỳ loại card mà cho lượng vi khuẩn thích hợp). Chọn 1 - 2 khuẩn lạc cho vào ống nghiệm chứa nước muối sinh lý.. Đối với card GPI nồng độ vi khuẩn trên máy colorimeter đạt 80 - 88%T (vạch đỏ). Đối với card GNI nồng độ vi khuẩn trên máy colorimeter đạt từ 67 - 77%T (vạch xanh da trời).
- Nạp vi khuẩn vào card: Nối ống hút vào card. Ấn chặt lỗ card ở bên sườn, cắm ống hút vào ống nghiệm chứa vi khuẩn theo đúng thứ tự card định danh. Đặt card và ống nghiệm lên giá đỡ, đặt đúng chiều sao cho miệng ống hút sát với đáy ống nghiệm mới hút đủ lượng vi khuẩn vào card và không tạo thành bọt khí trong card. Cho toàn bộ vào máy hút chân không của máy Vitek. Máy tự động hút vi khuẩn vào card sau 2 - 3 phút. Sau đú rút bỏ ống hút, nút lỗ card bằng nút nhựa rồi đưa vào máy đọc.
- Kiểm tra card trong máy ủ: Từ màn hình chính (computer), nhấn Vitek. Chọn Reader 1.
- Đọc kết quả: Thông thường máy tựđộng đọc và đưa ra kết quả nếu %Id > 80%. Máy sẽ tự động cho biết loài vi khuẩn và tự động chuyển sang phần mềm quản lý Bio - Lasion. Chuyển đổi kết quả:
Tất cả các card chỉ có giá trị khi còn trong máy, nếu bỏ card ra mà chưa chuyển sang chế độ Trans, kết quả sẽ bị mất. Do đó chỉ bỏ card định danh ra ngoài khi đó chuyển kết quả sang chếđộ Trans.
* Phương pháp kiểm tra vi sinh vật trong không khí
Sử dụng phương pháp lắng bụi của Koch để xác định tổng số vi sinh vật hiếu khí.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 34 Nguyên tắc: vi khuẩn trong không khí rơi xuống mặt đĩa thạch và phát triển thành khuẩn lạc (mỗi khuẩn lạc là một vi khuẩn), đếm số lượng khuẩn lạc mọc trên đĩa thạch. Theo công thức của V.Omealianski tính ra số lượng vi sinh vật (X) có trong một m3 không khí: X = K * S 100 * 100 * A Trong đó:
A : Số khuẩn lạc đếm được trong đĩa thạch S : Diện tích của đĩa petri (cm2)
K: Hệ số tương ứng với thời gian đểđĩa (5' = 1, 10' = 2, 15' = 3)
100: Diện tích quy ước (số vi khuẩn trên 100 cm2 thạch để trong thời gian 5' bằng tổng số vi khuẩn hiếu khí trong 10 lít không khí).
100: Hệ số nhân để tính ra kết quả trong 1m3 không khí.
* Chất lượng nước- xác định- phát hiện và đếm vi khuẩn coliform vi khuẩn coliform chịu nhiệt và Escherichia coli giảđịnh TCVN 6187-2:1996
Lấy mẫu và chuyển về phòng thí nghiệm theo TCVN 5992-1995 Chuẩn bị mẫu: Pha loãng mẫu và cấy vào môi trường phân lập theo ISO 8199 Nuôi cấy các ống thử: cấy các phần mẫu thử, đã được pha loãng hoặc không pha loãng vào một dãy ống nghiệm chứa một môi trường nuôi cấy chọn lọc dạng lỏng có lactoza.
Kiểm tra các ống thử sau 24h và 48h ở nhiệt độ 37ºC cấy chuyển tiếp từ mỗi ống có biểu hiện kèm theo sinh khí vào một môi trường khẳng định chọn lọc hơn và khi muốn tìm E.coli giảđịnh cấy vào một môi trường mà qua đó có thể quan sát thấy sự tạo thành indol. Các phép thử khẳng định nuôi các môi trường khẳng định này cho tới 48h ở nhiệt độ 37°C để phát hiện các vi khuẩn colifom chịu nhiệt và E.coli giảđịnh. Biểu thị kết quả bảng thống kê, tính toán số xác suất cao nhất của các dạng colifom. colifom chịu nhiệt và E.coli giảđịnh có thể có mặt trong 100
* Phương pháp xét nghiệm một số vi khuẩn ô nhiễm trong thịt ▪ Lấy mẫu:
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 35 chăn nuôi – phương pháp lẫy mẫu thân thịt tươi để phân tích vi sinh vật.
- QCVN 01 – 04: 2009/BNNPTNT, kỹ thuật lấy mẫu và bảo quản mẫu thịt tươi từ các cơ sở giết mổ và kinh doanh thịt để kiểm tra vi sinh vật.
▪ Xác định vi khuẩn trong thịt:
- Phương pháp xác định tổng số vi khuẩn hiếu khí: 4884:2005. - Phương pháp phát hiện và tính số Coliform: TCVN 4882:2007. - Phương pháp phát hiện và đếm số E. coli : TCVN 7924: 2/2008. - Phương pháp phát hiện Salmonella: TCVN 4829:2005.
- Phương pháp phát hiện và đếm số Staphylococcus aureus: TCVN
4830:1/2005.
- Phương pháp phát hiện, xác định Clostridium perfringens
: TCVN 4991:2005.