- Các chỉ tiêu ký sinh trùng
5. Xác định Staphylococcus aureus trong thịt theo TCVN 4830-1:
Nguyên lý:
Vi khuẩn Staphylococci phát triển tốt trên môi trường Baird Parker Agar Base có bổ sung Egg-Yolk Tellurite Emulsion (BP) tạo khuẩn lạc màu đen, tròn, lồi, bờ đều, bóng và có vòng trong suốt ở xung quanh do sự chuyển hóa của muối telorite de potassium và sự dung giải protein lòng đỏ trứng. Qua đó có thể đếm số lượng vi khuẩn dựa trên số khuẩn lạc mọc trên môi trường nuôi cấy.
Việc khẳng định vi khuẩn Staphylococci (S. aureus và các loài khác) dựa trên phản ứng đông huyết tương thỏ (coagulase).
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 73 Cách tiến hành:
Phân lập (cấy láng trên bề mặt thạch)
Sử dụng 6 đĩa môi trường BP để nuôi cấy ở 3 đậm độ pha loãng 10-1; 10-2; 10-3, mỗi độ pha loãng nuôi cấy trên 2 đĩa môi trường. Hút 0,1ml dung dịch mẫu ở mỗi độ pha loãng khác nhau lên bề mặt của các đĩa thạch. Sử dụng dụng cụ dàn mẫu dàn chất cấy trên bề mặt các đĩa thạch, để khô trong 15 phút ở nhiệt độ phòng. Lật ngược các đĩa và ủ ở 37oC/24h, đếm số lượng khuẩn lạc điển hình trên mỗi đĩa thạch, đánh dấu vị trí các khuẩn lạc điển hình. Ủ tiếp ở 37oC/24h, sau ủđánh dấu vị trí các khuẩn lạc điển hình mới và các khuẩn lạc không điển hình.
Phép thử coagulase:
Chọn các đĩa có số khuẩn lạc từ 15 đến 300 khuẩn lạc. Từ mỗi đĩa chọn 5 khuẩn lạc điển hình hoặc 5 khuẩn lạc không điển hình (nếu chỉ có một loại khuẩn lạc) hoặc 5 khuẩn lạc điển hình và 5 khuẩn lạc không điển hình (nếu chứa cả 2 loại khuẩn lạc). Từ mỗi khuẩn lạc đã chọn dùng que cấy vô trùng lấy 1 phần chuyển vào môi trường
Brain Heart Infusion (BHI), đem ủở 37°C/24h.
Sau ủ lấy 0,1ml mỗi dịch cấy vô trùng cho vào 0,3 ml huyết tương thỏ, ủ ở 37°C, sau 4 - 6h kiểm tra sự đông huyết tương. Nếu phản ứng âm tính, kiểm tra lại sau ủ 24h. Phản ứng dương tính khi thể tích kết dính chiếm hơn một nửa thể tích ban đầu của chất lỏng. Lấy khuẩn lạc điển hình có phản ứng catalase (+), coagulase (+) cấy trên môi trường thạch máu để thu được khuẩn lạc thuần nhất.
Tính kết quả:
Tính số lượng vi khuẩn S. aureus/gam sản phẩm như sau:
- Đối với các đĩa có chứa tối đa 300 khuẩn lạc, có 150 khuẩn lạc điển hình và/hoặc không điển hình, trên mỗi đĩa thạch đã chọn ở 2 độ pha loãng liên tiếp thì số lượng vi khuẩn S. aureus được tính theo công thức:
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 74 a : Số lượng vi khuẩn S. aureus ở 2 nồng độ pha loãng liên tiếp được chọn Ac : là số lượng khuẩn lạc điển hình đã qua phép thử coagulase
Anc: là số lượng khuẩn lạc không điển hình đã qua phép thử coagulase
bc : là số lượng khuẩn lạc điển hình cho thấy có phản ứng dương tính với coagulase
bnc : là số khuẩn lạc không điển hình cho thấy có phản ứng dương tính với coagulase
cc : là tổng số khuẩn lạc điển hình nhìn thấy trên đĩa cnc : là tổng số khuẩn lạc không điển hình nhìn thấy trên đĩa
Số lượng vi khuẩn Staphylococcus aureus/1g sản phẩm được tính theo công thức:
Trong đó:
∑a : là tổng số khuẩn lạc có phản ứng dương tính với coagulase đã nhận biết trên tất cả các đĩa đã chọn.
V : là thể tích của chất cấy trên mỗi đĩa, tính bằng mililit n1: là sốđĩa đã được chọn ởđộ pha loãng thứ nhất n2: là sốđĩa đã được chọn ởđộ pha loãng thứ 2
d : là độ pha loãng tương ứng với dung dịch pha loãng thứ nhất đã chọn - Nếu hai đĩa tương ứng với 2 mẫu thử hoặc huyền phù ban đầu, mỗi đĩa ít hơn 15 khuẩn lạc thì kết quả tính như sau:
Trong đó:
∑a: Tổng số khuẩn lạc Staphylococcus có phản ứng dương tính với coagulase nhận biết trên hai đĩa đã chọn.
d: Hệ số pha loãng của huyền phù ban đầu. V : Thể tích cấy trên mỗi đĩa
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 75 kì một khuẩn lạc Staphylocuccus nào có phản ứng dương tính với coagulase thì báo cáo kết quả như sau: “ Ít hơn 1/d Staphylococci có phản ứng dương tính với coagulase trong 1 gam sản phẩm, trong đó d là hệ số pha loãng của huyền phù ban đầu”.