- Các chỉ tiêu ký sinh trùng
4. Định tính vi khuẩn Salmonella trong thịt theo TCVN 4829:2005.
Nguyên lý:
Quá trình phát hiện Salmonella trong thực phẩm cần qua 4 giai đoạn kế tiếp nhau: (1) Tăng sinh sơ bộ mẫu đã được đồng nhất để đảm bảo phát hiện một lượng nhỏ hoặc Salmonella đã bị suy giảm hoạt tính → (2) Tăng sinh chọn lọc ở môi trường lỏng → (3) Phân lập nhằm tách và nhận dạng Salmonella khỏi các quần thể vi sinh vật khác trong mẫu → (4) Khẳng định đặc tính sinh hóa, huyết thanh học. Một số môi trường đặc đổ đĩa sử dụng để phân lập Salmonella như: thạch XLD, HE, ... Mỗi môi trường giúp nhận dạng các loài thuộc giống này dựa trên các đặc tính sinh hoá đặc trưng tương ứng.
Cách tiến hành:
Tăng sinh sơ bộ: Cân 25g mẫu trung bình đã cắt nhỏ vào túi PE vô trùng chuyên dụng, bổ sung thêm 225ml dung dịch đệm peptone, đồng nhất bằng máy dập mẫu Stomacher ở tốc độ 260 vòng/phút trong 1 phút thu huyễn dịch có nồng độ 10- 1. Ủ huyễn dịch mẫu đã đồng nhất ởđộ pha loãng 10-1 trong tủấm 37°C/18±2h.
Tăng sinh chọn lọc: Tiến hành trên 2 môi trường Rappaport-Vassiliadis (RVS) và Tetrathionate Broth Muller-Kauffmann (MKTTn)
Chuyển 0,1 ml dung dịch tiền tăng sinh vào ống nghiệm chứa 10 ml môi trường RVS, ủở 41,5°C/24h.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 72 MKTTn, ủ 37°C/24h.
Phân lập trên môi trường đặc chọn lọc và nhận dạng:
Sau khi ủ, sử dụng dịch tăng sinh chọn lọc trên ria cấy lên bề mặt thạch đĩa Xylose Lysine Deoxycholate Agar (XLD) và Hektoen enteric agar (HE).
Lật úp các đĩa đặt trong tủấm 37°C/24h. Khẳng định:
Nếu trên môi trường XLD hình thành khuẩn lạc màu hồng, trung tâm khuẩn lạc màu đen thì nghi là Salmonella.
Nếu trên môi trường HE hình thành khuẩn lạc màu đen thì nghi là
Salmonella.
Đánh dấu các khuẩn lạc Salmonella nghi trên mỗi đĩa. Ria cấy khuẩn lạc điển hình trên lên bề mặt đĩa thạch máu. Ủ ấm ở 37°C/24h để thu được khuẩn lạc thuần nhất. Các khuẩn lạc thuần này được dùng để để khẳng định các tính chất sinh vật hoá học trên hệ thống VITEK 2 compact và làm phản ứng huyết thanh học (HTH) với kháng huyết thanh O, H đa giá .
Tiến hành làm phản ứng HTH với kháng huyết thanh (KHT) đa giá O và kháng huyết thanh đa giá H (Phản ứng ngưng kết trên phiến kính). Trước khi làm phản ứng HTH cần kiểm tra khả năng tự ngưng kết của vi khuẩn. Nếu phản ứng tự ngưng kết âm tính ta tiếp tục tiến hành phản ứng ngưng kết với KHT O, H, Vi. Nếu phản ứng HTH dương tính (có hiện tượng ngưng kết) thì kết luận có sự hiện diện của vi khuẩn Salmonella trong mẫu thử.