- Các chỉ tiêu ký sinh trùng
6. Xác định tổng số vi khuẩn Clostridium perfringens trong thịt theo TCVN 4991:2005.
TCVN 4991:2005.
Nguyên lý:
Vi khuẩn C. perfringens yếm khí tuyệt đối, hình thành dạng khuẩn lạc đặc trưng màu đen trong môi trường Tryptose Sulfite Cycloserine Agar (TSC) ở điều kiện yếm khí. Do đó, có thể đếm số khuẩn lạc mọc trong môi trường và từ đó xác định số lượng vi khuẩn có mặt trong mẫu phân tích.
Cách tiến hành: Phân lập :
Cấy ở 3 độ pha loãng 10-1; 10-2; 10-3, mỗi độ pha loãng nuôi cấy trên 2 đĩa môi trường. Dùng pipet vô trùng chuyển 1ml huyễn dịch mẫu ở các độ pha loãng tương ứng vào các đĩa petri vô trùng. Rót 10 - 15ml môi trường thạch TSC được duy trì ở 44°C - 47°C vào giữa đĩa petri, xoay nhẹđĩa để trộn đều dịch cấy vào môi trường, để môi trường đông tự nhiên ở nhiệt độ phòng. Phủ thêm một lớp khoảng 10 ml môi trường thạch TSC lên bề mặt các đĩa thạch TSC đã đông trên, để đĩa thạch đông tự nhiên trên bề mặt nằm ngang. Đặt các đĩa vào bình nuôi cấy yếm khí, dùng các pack yếm khí (anaerobical pack) để tạo điều kiện yếm khí. Ủở 370C/ 18 - 20h. Đếm các đĩa thạch chứa ít hơn 150 khuẩn lạc màu đen, chọn 5 khuẩn lạc điển hình để khẳng định sinh hóa.
Khẳng định sinh hóa: Sử dụng môi trường lactoza sunfit (LS)
Cấy từng khuẩn lạc điển hình đã chọn vào môi trường Thioglycolate lỏng, ủ kỵ khí ở 37°C/18 - 24h. Sau thời gian ủ, chuyển ngay 5 giọt dịch cấy trong môi trường thioglycolate cấy vào môi trường LS, ủ hiếu khí ở 46oC/18 - 24h. Các ống dương tính có hiện tượng sinh khí và kết tủa đen của sắt sulfit. Vi khuẩn hình thành khuẩn lạc điển hình màu đen trên môi trường thạch SC và được khẳng định dương tính với môi trường LS được coi là Clostridium perfringens.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 76 Tính kết quả:
Đếm số khuẩn lạc điển hình trên các đĩa petri của 2 độ pha loãng liên tiếp có số khuẩn lạc không quá 150.
Số vi khuẩn C. perfringens trong 1 gam thịt được tính theo công thức:
Trong đó:
C: Tổng số khuẩn lạc đếm được trên tất cả các đĩa ở 2 độ pha loãng liên tiếp. X: Số vi khuẩn C. perfringens trong 1 gam thịt (CFU/g)
n1: là sốđĩa ởđộ pha loãng thứ nhất được đếm. n2: là sốđĩa ởđộ pha loãng thứ 2 được đếm.
d : hệ số pha loãng với độ pha loãng thứ nhất được đếm.
Nếu các đĩa của 2 độ pha loãng liên tiếp có số khuẩn lạc từ 15 - 30, tính số khuẩn lạc của mỗi độ pha loãng và kết quả là trung bình số học của 2 giá trị thu được.
Nếu 2 đĩa nuôi cấy ứng với độ pha loãng 10-1 có số khuẩn lạc < 15 thì:
Nếu 2 đĩa nuôi cấy ởđộ pha loãng 10-1 không có khuẩn lạc nào thì:
Với: m là trung bình của số khuẩn lạc ở 2 đĩa d là độ pha loãng của huyễn dịch ban đầu, d = 10-1