- Phịng thí nghiệm chuyên sâu, Trường Đại học Cần thơ Viện kiểm nghiệm TP HCM.
2.2.4.Các phương pháp thử nghiệm sinh học 1 Các thử nghiệm vi sinh
2.2.4.1. Các thử nghiệm vi sinh
Thử nghiệm tính kháng khuẩn của tinh dầu tràm trà Úc
Vi khuẩn thử nghiệm: sử dụng các chủng vi khuẩn thường hay gây nhiễm các vết bỏng, vết thương mất da như Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Streptococcus hemolyticus, và chủng MRS phân lập từ vết thương.
Vi khuẩn được phân lập trên mơi trường thích hợp 24 giờ (mơi trường thử nghiệm kháng sinh tiêu chuẩn 2 đối với thử nghiệm Staphylococcus aureus, Streptococcus hemolyticus và mơi trường thạch Pseudomonas đối với thử nghiệm Pseudomonas aeruginosa). Lấy 3 – 5 khĩm vi khuẩn cấy vào mơi trường canh thang dinh dưỡng cho thử nghiệm kháng sinh tiêu chuẩn 2, ủở 35 oC trong 6 giờ. Sử dụng vi khuẩn
55
này pha một huyền trọc vi khuẩn cĩ mật độ vi khuẩn vào khoảng 1 x 106 – 2 x106 CFU/ ml.
Mơi trường thử nghiệm: mơi trường thạch Pseudomonas [4], mơi trường thạch dinh dưỡng cho thử nghiệm kháng sinh tiêu chuẩn No2.
Xác định MIC bằng phương pháp pha lỗng trong mơi trường rắn: tạo những bản thạch cĩ chứa chất thử nghiệm với nồng độ tăng dần. Chấm 1 µl vi khuẩn thử nghiệm với nồng độ 106 CFU / ml lên các bản thạch. Sau khi ấp ở 37 ºC trong 24 giờ, quan sát sự tăng trưởng của vi khuẩn bằng mắt thường. Nồng độ MIC là nồng độ thấp nhất ngăn cản sự tăng trưởng của vi khuẩn quan sát được bằng mắt thường.
Thử nghiệm tính kháng khuẩn của màng trị bỏng Acetul
Phương pháp thử nghiệm trên mơi trường rắn: khảo sát khả năng ức chế sự tăng trưởng của vi khuẩn thử nghiệm của màng Acetul khi đặt màng trên bề mặt bản thạch dinh dưỡng cĩ trải vi khuẩn thử nghiệm.
Vi khuẩn thử nghiệm: Staphylococcus aureus, Streptococcus hemolyticus, Pseudomonas aeuginosa, MRSA. Vi khuẩn được phân lập trên mơi trường thích hợp (mơi trường dinh dưỡng cho thử nghiệm kháng sinh tiêu chuẩn 2 đối với thử nghiệm Staphylococcus aureus, Streptococcus hemolyticus, MRSA và mơi trường thạch Pseudomonas đối với thử nghiệm trên Pseudomonas aeruginosa) 24 giờ. Lấy 3 – 5 khĩm vi khuẩn cấy vào mơi trường canh thang dinh dưỡng cho thử nghiệm kháng sinh tiêu chuẩn 2, ủở 35 oC trong 6 giờ. Sử dụng vi khuẩn này pha một huyền trọc vi khuẩn cĩ mật độ vi khuẩn vào khoảng 1 x 106 CFU/ ml – 2 x 106 CFU / ml.
Chuẩn bị mẫu: dùng một kéo vơ khuẩn cắt đơi màng Acetul.
Phương pháp: dùng que bơng vơ khuẩn tẩm huyền trọc vi khuẩn trải đều trên bề mặt hộp thạch chứa mơi trường thử nghiệm. Lấy ½ miếng màng Acetul ra khỏi bao và đặt trên ½ mặt bản thạch, ép sát màng vào bề mặt bản thạch. Dùng băng parafin dán kín hộp thạch thử nghiệm. Ủ hộp thạch ở 35 oC trong 24 giờ. Quan sát kết quả.
56
Mẫu chứng: kết quảđược so sánh với mẫu chứng. Mẫu chứng là màng BC tinh chế chưa phối hợp với các chất kháng khuẩn. Thử nghiệm trên mẫu chứng giống như thực hiện trên mẫu thử.
Đánh giá kết quả: màng cĩ khả năng ức chế vi khuẩn khi phần thạch cĩ phủ màng khơng cĩ sự tăng trưởng của vi khuẩn (quan sát bằng mắt thường) và tạo vùng vơ khuẩn. Phần khơng phủ màng vi khuẩn phát triển mạnh.
Thử nghiệm tính kháng khuẩn bằng phương pháp đếm sống trên các chủng vi khuẩn phân lập từ vết bỏng.
Trên các hộp thạch chứa mơi trường dinh dưỡng tiêu chuẩn, trải 0,5 ml huyền trọc mỗi vi khuẩn P. aeruginosa, S. aureus (phân lập từ vết bỏng) ở nồng độ 105 CFU / mltrên mặt thạch, sau đĩ phủ màng Acetul và băng nano bạc. Để các hộp thạch ở 37 oC/ 24 giờ. Quan sát lượng vi khuẩn mọc bên dưới màng ở các hộp thạch, sau đĩ đếm số lượng vi khuẩn ở các hộp bằng phương pháp đếm sống.
Thử nghiệm khả năng kháng khuẩn của màng nghiên cứu trên vết thương bỏng nơng
Lấy bệnh phẩm và xử lý bệnh phẩm trên cùng một vị trí bỏng đắp màng điều trị ở cả 2 lần xét nghiệm trước và sau nghiên cứu 7 ngày. Dùng tấm nhựa cĩ một ơ trống 1 cm2 đã vơ khuẩn đặt lên bề mặt vết bỏng. Dùng tăm bơng vơ khuẩn nhúng ướt trong dung dịch NaCl 0,9 % vơ khuẩn, ấn đầu tăm bơng vào thành ống thuỷ tinh để giảm bớt nước, lăn nhẹ lên vết thương, lăn khắp cả khoảng trống của tấm nhựa, lăn chậm sao cho dịch vết bỏng thấm lên tồn chu vi tăm bơng trong khoảng 20 giây. Cho tăm bơng đã lấy bệnh phẩm vào ống nghiệm cĩ sẵn 5 ml dung dịch NaCl 0,9 % vơ khuẩn. Lắc trịn nhẹ, đều tay ống dung dịch NaCl 0,9 % trong khoảng 1 phút. Đếm số lượng vi khuẩn trong ống dung dịch NaCl 0,9 % bằng phương pháp pha lỗng và trải bản thạch. Tính kết quả theo cơng thức:
CFU /cm2 bề mặt vết bỏng = Số khuẩn lạc x Độ pha lỗng x Số ml trải bản thạch
57
Thử nghiệm độ vơ khuẩn của màng Acetul được thực hiện theo phương pháp thử nghiệm trong chuyên đề “Thử độ vơ khuẩn của sản phẩm” phương pháp dùng màng lọc trong USP 28.[102]