- Phịng thí nghiệm chuyên sâu, Trường Đại học Cần thơ Viện kiểm nghiệm TP HCM.
2.2.1.Nuơi cấy A.xylinum tạo màng cellulose
Quá trình tạo màng cellulose từ vi khuẩn A. xylinum gồm hai giai đoạn: giai đoạn nhân giống và giai đoạn lên men tạo màng BC.
Giai đoạn nhân giống nhằm tạo ra một lượng lớn giống A. xylinum ổn định ở giai đoạn tăng sinh để sử dụng cho quá trình lên men tạo cellulose ở giai đoạn sau.
2.2.1.1. Nhân giống A. xylinum
44
- Khảo sát mơi trường nuơi cấy nhân giống: nhằm xác định nguồn nitơ thích hợp và ảnh hưởng của yếu tố tăng trưởng.
- Xác định các yếu tố vật lý ảnh hưởng đến quá trình nhân giống như yếu tố thơng khí trong quy trình nuơi cấy, pH mơi trường thích hợp cho sự tăng trưởng và thời gian nhân giống.
- Xác định đường cong tăng trưởng để biết thời gian thu sinh khối thích hợp. Qui trình nhân giống gồm các giai đoạn:
Giai đoạn hoạt hĩa giống: đây là giai đoạn chuyển giống từ trạng thái tiềm ẩn sang giai đoạn tăng sinh (giai đoạn logarit) cĩ khả năng tăng sinh nhanh và các đặc tính sinh hĩa ổn định.
- Hoạt hĩa lần thứ nhất: lấy vi khuẩn trong mơi trường thạch nghiêng của ống gốc cho vào 50 ml mơi trường nhân giống, cho vào máy lắc, nhiệt độ 30 0C trong 72 giờ.
- Kiểm tra giống: sau khi hoạt hĩa, kiểm tra tính tinh khiết của giống. Giống khơng được nhiễm vi khuẩn lạ, vi khuẩn A. xylinum phải ở dạng hoạt hĩa cĩ hình dạng và kích thước đặc trưng: tế bào cĩ dạng que hơi cong, hai đầu trịn hoặc dạng bầu dục dài.
- Hoạt hĩa lần thứ hai: giống vi khuẩn sau khi kiểm tra đạt tiêu chuẩn tinh khiết và hình dạng đặc trưng được tiếp tục hoạt hĩa lần thứ 2: cho giống vào mơi trường nhân giống mới theo tỷ lệ nhân giống là 1/10, nuơi cấy trong máy lắc ở nhiệt độ 30 oC trong 72 giờ.
- Đếm số vi khuẩn trong 1 ml mơi trường ban đầu, đến khi đạt được số lượng vi khuẩn khoảng 108 vi khuẩn/ml mơi trường, đây là giống đã hoạt hĩa được sử dụng cho giai đoạn nuơi cấy nhân giống với thể tích mơi trường lớn.
Giai đoạn nhân giống: vi khuẩn sau khi hoạt hĩa được cho vào mơi trường khảo sát và nuơi cấy động trên máy lắc. Sau các khoảng thời gian, xác định số lượng vi khuẩn trong 1 ml mơi trường nuơi cấy.
Khảo sát nguồn nitơ thích hợp cho quá trình nhân giống: khảo sát sự tăng trưởng của A. xylinum với 2 nguồn nitơ là cao chiết nấm men và pepton từ thịt. Nuơi cấy
45
vi khuẩn ở các nồng độ chất thử nghiệm khác nhau, xác định hiệu quả nuơi cấy tính bằng sinh khối thu được (số vi khuẩn / ml mơi trường nuơi cấy) và xử lý số liệu thống kê đểđánh giá kết quả.
Khảo sát ảnh hưởng của yếu tố tăng trưởng: vi khuẩn A. xylinum cần một số yếu tố tăng trưởng như các vitamin, khống chất. Các chất này thường cĩ trong dịch ép trái cây, nước dừa, nước mía, rỉ đường. Ngồi vai trị như nguồn carbon, các nguyên liệu trên cịn là nguồn cung cấp các yếu tố tăng trưởng. Do yêu cầu cao về độ tinh khiết của màng trị bỏng và tính kinh tế nên nguồn nước dừa được chọn là nguồn cung cấp các yếu tố tăng trưởng.
Vi khuẩn A. xylinum được nuơi cấy động trong mơi trường nước dừa già và mơi trường khơng cĩ nước dừa. Đánh giá hiệu quả của nước dừa đối với sự tăng trưởng của vi khuẩn này qua sinh khối thu được từ các mơi trường thử nghiệm.
Khảo sát pH thích hợp cho quá trình tăng trưởng: pH mơi trường ảnh hưởng đáng kể đến sự tăng trưởng của vi khuẩn. Mỗi lồi cĩ một pH thích hợp nhất cho sự tăng trưởng. A. xylinum là vi khuẩn cĩ khả năng chịu được pH acid trong quá trình tăng trưởng. Vì vậy cần khảo sát xác định pH thích hợp cho qui trình nhân giống A. xylinum. Nuơi cấy động vi khuẩn trong các mơi trường cĩ pH khác nhau: pH 4,5; 5,5 ; 6; 6,5; 7,5. Đánh giá hiệu quả nuơi cấy bằng sinh khối thu được.
Xác định thời gian thu sinh khối: sau khi xác định được mơi trường thích hợp, vi khuẩn được nuơi trong mơi trường này. Lượng sinh khối vi khuẩn được xác định theo thời gian, từ đĩ xác định thời gian thu sinh khối tối ưu trong giai đoạn tăng sinh.
Phương pháp đánh giá hiệu quả của quá trình nuơi cấy nhân giống: đánh giá bằng sinh khối vi khuẩn (số tế bào) thu được / ml mơi trường.
Phương pháp xác định số lượng vi khuẩn: sử dụng 2 phương pháp sau:
(1) Phương pháp đếm trực tiếp tế bào vi khuẩn dưới kính hiển vi: phương pháp sử dụng buồng đếm hồng cầu.
(2) Phương pháp đếm sống: đếm số lượng khuẩn lạc phát triển trên mơi trường thạch bằng phương pháp pha lỗng và trải bản thạch.
46
Sử dụng cả hai phương pháp để đánh giá sinh khối. Với phương pháp sử dụng buồng đếm hồng cầu cải tiến Neubauer cho kết quả nhanh chĩng, dùng để xác định tổng số vi khuẩn ở thời điểm ban đầu, sau đĩ kết quảđược tiếp tục xác định bằng phương pháp đếm sống.
Khảo sát mơi trường, điều kiện lý hĩa quá trình nhân giống
Sơ đồ 2.1. Các giai đoạn nhân giống 2.2.1.2. Lên men thu BC (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Quá trình lên men A. xylinum thu BC trong điều kiện nuơi cấy tĩnh.Cĩ nhiều yếu tố ảnh hưởng đến quá trình này cần nghiên cứu như nguồn dinh dưỡng, pH mơi trường, lượng giống sử dụng ban đầu.
Nguồn dinh dưỡng: khảo sát nguồn carbon, nguồn nitơ, vai trị của nước dừa già đối với quá trình tạo BC.
Điều kiện nuơi cấy
+ Tìm pH thích hợp: nuơi cấy A. xylinum trong khoảng pH từ pH 4,5 đến pH 7,0. Xác định pH tốt nhất cho hiệu suất tạo BC cao. Giống A. xylinum Hoạt hĩa lần 1 Hoạt hĩa lần 2 Thu hoạch giống A. xylinumđã hoạt hĩa Thu hoạch giống cho giai đoạn lên men
47
+ Xác định lượng giống vi khuẩn thích hợp đưa vào mơi trường lên men: thử nghiệm lên men vi khuẩn với những số lượng vi khuẩn ban đầu khác nhau: 104 CFU/ ml; 105 CFU/ ml; 106 CFU/ ml.
Qui trình lên men
Dịch nhân giống được cho vào mơi trường lên men tạo BC sau đĩ cho vào hộp nhựa đã được hấp tiệt trùng. Nuơi cấy tĩnh trong bảy ngày, thu sản phẩm màng BC thơ, sau đĩ tinh chế màng.
Cho vào các hộp nhựa
12 cm x 22 cm x 10 cm
Thời gian : 7 ngày
Sơ đồ 2.2. Quy trình lên men A. xylinum thu BC
Đánh giá kết quả: xác định hiệu suất BC thu được. Màng BC sau khi tinh chế được sấy trong tủ sấy ở 105 oC, áp suất thường đến khối lượng khơng đổi (sự chênh lệch khối lượng sau khi sấy thêm một giờ trong tủ sấy so với lần sấy trước đĩ khơng quá 0,5 mg, theo Phụ lục 5, trang phụ lục 98, DĐVN III, 2002),[4] được khối lượng BC khơ. So sánh hiệu suất tạo BC (g/l) của từng mơi trường và các
Thu hoạch màng BC thơ Giống A. xylinum từ giai đoạn nhân giống Lên men Nuơi cấy tĩnh Khảo sát các điều kiện lên men
48
điều kiện khảo sát để tìm được mơi trường và các thơng số thích hợp cho năng suất tạo BC cao.