Nghiệm thức 1: IVF từ nguồn TBT MII đông lạnh chưa xử lí Taxol Nghiệm thức 2: IVF từ nguồn TBT MII đông lạnh có xử lí Taxol
Nghiệm thức 3: IVF từ nguồn TBT non đông lạnh dùng vật mang là cọng rạ
Bảng 3.20. So sánh hiệu quả IVF từ TBT đông lạnh Nghiệm thức Số TBT đem thụ tinh
Tỉ lệ các giai đoạn phát triển của phôi (%)
Phôi 2 TB Phôi 4-8 TB Phôi dâu Phôi nang
1 781 12,93 ± 1,2 a (101) 11,01 ± 1,12a (86) 5,76 ± 0,83a (45) 3,71 ± 0,68ac (29) 2 578 23,18 ± 1,76 b (134) 14,71 ± 1,47b (85) 7,44 ± 1,09a (43) 5,71 ± 0,97a (33) 3 179 15,64 ± 2,72 a (28) 9,50 ± 2,19ab (17) 3,35 ± 1,35a (6) 1,12 ± 0,79bc (2)
Tỉ lệ thụ tinh ở nghiệm thức 2 cao nhất (23,18%), kế đến là nghiệm thức 3 (15,64%) và sau cùng là nghiệm thức 1 (12,93%). Sự phát triển của phôi qua các giai đoạn chính cũng theo thứ tự như vậy. Tỉ lệ thụ tinh ở nghiệm thức 2 cao gấp 1,8 lần so với nghiệm thức 1 (P < 0,001); cao gấp 1,48 lần so với nghiệm thức 3 (P < 0,05); không khác biệt so với nghiệm thức 1 (P > 0,05). Kết quả này chứng tỏ các TBT MII khi được bảo quản lạnh cho tỉ lệ thụ tinh tốt hơn so với các TBT GV được bảo quản lạnh; các TBT MII được bảo lạnh có xử lí trước với Taxol + 5% FCS và sau giải đông xử lí nhanh với dung dịch acid Tyrode cho tỉ lệ thụ tinh cao hơn so với nhóm không được xử lí trước với Taxol.
Giai đoạn phôi 8-16 tế bào ở nghiệm thức 2 cao hơn so với nghiệm thức một 1,34 lần (P < 0,05); không khác biệt so với hai nghiệm thức còn lại (P > 0,05), nhưng nghiệm thức 2 cao hơn nghiệm thức 3 ở độ tin cậy 92,6% (xem phụ lục 3, mục 8.2). Kết quả này cho thấy, tỉ lệ phát triển của phôi 2TB lên phôi 8-16 TBT cao hơn khi tiến hành IVF từ các TBT MII được bảo quản lạnh có xử lí trước với Taxol và 5% FCS.
Giai đoạn phôi dâu, tỉ lệ phân chia của phôi ở cả ba nghiệm thức có khác nhau, nhưng sự khác biệt này không có ý nghĩa thống kê (P > 0,05). Như vậy, nguồn TBT
đem IVF không ảnh hưởng đến tỉ lệ phân chia của giai đoạn phôi dâu.
Giai đoạn phôi nang, nghiệm thức 2 đạt tỉ lệ cao nhất (5,71%), cao hơn so với nghiệm thức 3 5,55 lần (P < 0,05); không khác biệt so với nghiệm thức 1 ở độ tin cậy 95% (P > 0,05). Tuy nhiên, tỉ lệ phôi nang ở nghiệm thức 2 và nghiệm thức 1 khác biệt nhau ở độ tin cậy 91,9%. Cụ thể, tỉ lệ phôi nang trong nghiệm thức 2 cao hơn nghiệm thức một 1,54 lần. Tỉ lệ phôi nang ở nghiệm thức 1 và nghiệm thức 3 khác biệt nhau ở độ tin cậy 92,4%. Cụ thể, tỉ lệ phôi nang trong nghiệm thức 1 cao hơn nghiệm thức ba 3,32 lần (xem phụ lục 3, mục 8.2).
Như vậy có thể thấy, kết quả nghiệm thức 2 là tối ưu trong cả 3 nghiệm thức.
sung Taxol cho hiệu quả tốt hơn so với không bổ sung Taxol. Ở nghiệm thức 3, do những lần thí nghiệm đầu không có phôi phát triển đến giai đoạn phôi nang nên tỉ lệ
trung bình về phôi nang thấp, chỉ đạt 1,12% (Xem phụ lục). Tuy nhiên với kết quả đạt được cũng phần nào khẳng định được sự thành công bước đầu trong việc tạo phôi từ các TBT MII và GV được bảo quản lạnh. Cần có những nghiên mở rộng hơn, sâu hơn nhằm tìm ra quy trình tối ưu cho việc thủy tinh hóa TBT bò ở các giai
đoạn.
Tóm lại, trong quá trình thí nghiệm cho thấy, việc bảo quản lạnh TBT bò giai
đoạn MII bằng phương pháp thủy tinh hóa trong cọng rạ cho kết quả tốt hơn so với giai đoạn GV. Đồng thời, trước khi bảo quản nên xử lí với 1µM Taxol và sau khi giải đông nên xử lí nhanh với dung dịch acid Tyrode 10% trong 20 giây, cho kết quả tốt hơn so với nhóm không được xử lí với Taxol.
KẾT LUẬN
Từ kết quả nghiên cứu trên đây, đề tài đã đạt được mục tiêu đề ra, trong đó kết quả
thứ nhất và thứ hai là nổi bật nhất.
1. Đã cải tiến được quy trình đông lạnh tế bào trứng bò giai đoạn MII bằng phương pháp thủy tinh hóa phù hợp với điều kiện Việt Nam: bổ sung 1µM Taxol vào môi trường cân bằng, môi trường thủy tinh hóa và bổ sung 10% dung dịch acid Tyrode vào môi trường sau khi giải đông bước 3 đã nâng cao tỉ lệ sống, tỉ lệ thụ
tinh tăng gần gấp 2 lần so với môi trường cơ bản, tăng sự phát triển của phôi sau khi thụ tinh trong ống nghiệm (64,51 ± 1,33%; 23,18 ± 1,76%; 5,71 ± 0,97%, tương
ứng);
2. TBT bò ở giai đoạn GV sau khi bảo quản lạnh bằng cọng rạ hoặc vi giọt có thể
nuôi chín in vitro trong môi trường cải tiến (TCM-199 + 10% FBS + 5% FCS + 10ng/ml EGF + 10IU/ml hCG + 0,2mM Natri pyruvate + 50µg/ml Gentamycin bổ sung 10% dịch nang trứng), tỉ lệ chín đạt 20,79 ± 1,38% và 12,79 ± 1,13%, tương ứng. 3. Đã thành công trong việc tạo phôi in vitro từ nguồn tế bào trứng giai đoạn GV
đông lạnh bằng cọng rạ và được nuôi chín in vitro, tỉ lệ thụ tinh đạt 15,64 ± 2,72%, có phôi phát triển đến giai đoạn phôi nang.
4. Bước đầu đã thử nghiệm cấy truyền phôi tạo ra từ nguồn TBT MII đông lạnh thành công, kết quả cho 2 bê con ra đời khỏe mạnh.
KIẾN NGHỊ
1. Trên cơ sở kết quả đạt được của đề tài, cần tiếp tục nghiên cứu đông lạnh tế bào bò giai đoạn MII bằng phương pháp thủy tinh hóa dùng các chất bảo vệ lạnh có bổ sung Taxol với các nồng độ khác và xử lý nhanh với dung dịch acid Tyrode. 2. Khảo sát sự tổn thương của các TBT bò sau khi bảo quản lạnh bằng phương pháp
nhuộm PI kết hợp với kháng thểα-tubulin.
3. Tiến hành thêm các thí nghiệm cấy truyền phôi theo các quy trình khác nhằm chứng minh chất lượng phôi được tạo ra từ TBT đông lạnh.
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH LIÊN QUAN ĐẾN ĐỀ TÀI
ĐÃ ĐƯỢC CÔNG BỐ
1. Nguyễn Thị Thương Huyền, Võ Thị Tuyết Nga, Nguyễn Thị Thanh Xuân, Hoàng Thị Bích Tuyền, Nguyễn Thị Phương Dung, Đặng Thị Thu Thủy, Phan Kim Ngọc (2008), “Bảo quản trứng bò trưởng thành bằng phương pháp thủy tinh hóa trong cọng rạ”, Hội nghị khoa học lần thứ 6, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Tp. HCM, trang 224.
2. Nguyễn Thị Thương Huyền, Phạm Văn Phúc, Hoàng Nghĩa Sơn, Phan Kim Ngọc (2009), “Tạo phôi bò bằng kỹ thuật thụ tinh In Vitro từ nguồn giao tử đông lạnh”, Tạp chí Công nghệ Sinh học, ISSN 1811-4989, Tập 7 số 2, trang 161-167. 3. Phan Kim Ngọc, Phạm Văn Phúc, Nguyễn Thị Thương Huyền, Dương Thị Thư, Nguyễn Thị Minh Nguyệt (2009). “So sánh kết quả tạo phôi bò bằng kỹ thuật IVF trứng tươi và trứng đông lạnh với tinh trùng đông lạnh”. Tạp chí Công nghệ Sinh học, ISSN 1811-4989, Tập 7 số 4 năm 2009, trang 435-441.
4. Nguyen Thi Thuong Huyen, Pham Van Phuc, Le Thanh Long, Duong Thi Thu, Chung To Nhi, Phan Kim Ngoc (2009) “Experiment on frozen in vitro bovine embryo transfer after sexing by LAMP method”. The 6th annual conference of
the Asian Reproductive Biotechnology Society, Siem Reap, Cambodia,
November 16-20, 2009, P 108.
5. Võ Thị Tuyết Nga*, Nguyễn Thị Thương Huyền*, Bùi Thị Thu Trang, Nguyễn Quốc Đạt, Nguyễn Thị Thoa, Phan Kim Ngọc (2010) “Nghiên cứu cải thiện môi trường nuôi chín trứng từ nguồn trứng bò đông lạnh ở giai đoạn túi mầm”, Tạp chí Khoa học Kỹ thuật Chăn nuôi, ISSN 0868-3417, tháng 03/2010, trang 10-16. 6. Nguyễn Thị Thương Huyền, Nguyễn Thành Trung, Nguyễn Vũ Hoàng Linh, Lê
Thành Long, Hoàng Nghĩa Sơn, Phan Kim Ngọc (2012), “Những tác động của Taxol lên việc bảo quản lạnh tế bào trứng bò bằng phương pháp thủy tinh hóa”, Tạp chí Sinh học, ISSN 0866-7160, tập 34 - số 3SE, trang 299-305.
7. Nguyen Thi Thuong Huyen, Le Thanh Long, Nguyen Quoc Dat, Hoang Nghia Son (2013), Effects of Taxol in cryopreservation of mature bovine oocytes by
vitrification. The 10th annual conference of the Asian Reproductive Biotechnology Society, Sea -Links Mui Ne, Phan Thiet, Vietnam, 19-25/8/2013, P8.
8. Nguyễn Thị Thương Huyền, Lâm Sơn Bích Trâm, Nguyễn Quốc Đạt, Hoàng Nghĩa Sơn, Phan Kim Ngọc (2013), “Bảo quản lạnh tế bào trứng bò giai đoạn túi mầm bằng phương pháp thủy tinh hóa trong cọng rạ và vi giọt”. Kỷ yếu Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc khu vực phía Nam lần III, O4-3, trang 184.
TIẾNG VIỆT
1. Chung Anh Dũng (2011), Công nghệ sinh sản trên bò, NXB Nông nghiệp. 2. Nguyễn Hữu Đức, Nguyễn Thị Ước, Lê Văn Ty, Quản Xuân Hữu, Nguyễn
Trung Thành, Bùi Linh Chi, Nguyễn Văn Hạnh, Nguyễn Thùy Anh, Nguyễn Việt Linh, Bùi Xuân Nguyên (2003), Kết quả thụ tinh ống nghiệm và cấy phôi ở bò lai Sind. Hội nghị Công nghệ sinh học toàn quốc, NXB Khoa học và Kỹ thuật Hà Nội.
3. Hoàng Kim Giao, Nguyễn Thanh Dương, Lê Thị Thúy (2003), Công nghệ cấy truyền phôi ở gia súc, NXB Khoa học Kỹ thuật.
4. Lưu Công Khánh, Nguyễn Thị Thoa, Nguyễn Thị Kim Anh, Nguyễn Văn Lý, Phan Lê Sơn, Chu Thị Yến, Đặng Vũ Hòa, Hoàng kim Giao (2003),
Nghiên cứu ứng dụng đông lạnh phôi bò bằng glycerol trong công nghệ cấy truyền phôi. Hội nghị CNSH toàn quốc, NXB Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội. 5. Nguyễn văn Lý (2006), "Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến kết quả thụ
tinh trong ống nghiệm bò ở Việt Nam", Luận án Tiến sỹ.
6. Phan Kim Ngọc, Hồ Huỳnh Thùy Dương (2001), Sinh học của sự sinh sản, NXB Giáo dục.
7. Phan Kim Ngọc, Phạm Văn Phúc (2006), Công nghệ sinh học Người và Động vật, NXB Giáo dục.
8. Phan Kim Ngọc và cs. (2009), "Tạo phôi bò sữa giai đoạn phôi nang bằng công nghệ thụ tinh trong ống nghiệm từ nguồn giao tử nội và ngoại nhập",
Đề tài cấp thành phố.
9. Bùi Xuân Nguyên, Nguyễn Hữu Đức, Lê Văn Ty, Nguyễn Thị Ước (1997), "Khảo sát khả năng cung cấp trứng để thụ tinh in vitro: nghiên cứu so sánh ở
trâu và bò nội", Kỷ yếu Viện Công nghệ Sinh học 1997. Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội: p. 510-517.
10. Đào Đức Thà (2010), "Nghiên cứu tạo phôi lợn trong ống nghiệm, đông lạnh phôi lợn, thuộc đề tài : "Nghiên cứu tổ hợp công nghệ sinh sản phục vụ công tác tạo và nhân giống lợn" đề tài cấp nhà nước, thuộc chương trình KHCN. TS. Đào Đức Thà".
11. Nguyễn Thị Thoa (2010), "Nghiên cứu tổ hợp công nghệ sinh sản phục vụ
công tác tạo và nhân giống bò", Đề tài cấp nhà nước giai đoạn 2007 -2010 thuộc “Chương trình trọng điểm ứng dụng công nghệ sinh học trong nông nghiệp”, Viện chăn nuôi Quốc gia.
12. Hồ Mạnh Tường, Đặng Quang Vinh, Vương Thị Ngọc Lan (2011), Thụ tinh trong ống nghiệm, NXB Giáo dục Việt Nam.
13. Phan Khánh Vy, Phan Trường Duyệt (2001), Thụ tinh trong ống nghiệm (các vấn đề có liên quan đến phòng thí nghiệm), NXB Y học.
TIẾNG ANH
14. Abe, H., S. Yamashita, T. Satoh, and H. Hoshi (2002), "Accumulation of cytoplasmic lipid droplets in bovine embryos and cryotolerance of embryos developed in different culture systems using serum-free or serum-containing media", Mol Reprod Dev, 61(1): p. 57-66.
15. Abe, H., Yamashita, S., Itoh, T., Satoh, T. and Hoshi, H. (1999), "Histochemical and ultrastructural evaluations of cytoplasmic lipid droplets in bovine embryos cultured in serum-free and serum containing media", Theriogenology, 51: p. 232. 16. Abe, Y., K. Hara, H. Matsumoto, J. Kobayashi, H. Sasada, H. Ekwall, H.
Rodriguez-Martinez, and E. Sato (2005), "Feasibility of a nylon-mesh holder for vitrification of bovine germinal vesicle oocytes in subsequent production of viable blastocysts", Biol Reprod, 72(6): p. 1416-1420.
17. Agca, Y., J. Liu, A.T. Peter, E.S. Critser, and J.K. Critser (1998), "Effect of developmental stage on bovine oocyte plasma membrane water and cryoprotectant permeability characteristics", Mol Reprod Dev, 49(4): p. 408-415.
18. Agca, Y., J. Liu, J.J. Rutledge, E.S. Critser, and J.K. Critser (2000), "Effect of osmotic stress on the developmental competence of germinal vesicle and metaphase II stage bovine cumulus oocyte complexes and its relevance to cryopreservation",
Mol Reprod Dev, 55(2): p. 212-219.
19. Ahern, T.J.a.G., D.K. (1998), "Culturing bovine embryos in groups stimulates blastocyst development and cell allocation to the inner cell mass", Theriogenology, 49: p. 194 (abstract.
20. Albarracin, J.L., R. Morato, D. Izquierdo, and T. Mogas (2005), "Vitrification of calf oocytes: effects of maturation stage and prematuration treatment on the nuclear and cytoskeletal components of oocytes and their subsequent development", Mol Reprod Dev, 72(2): p. 239-249.
21. Albertini, D.F., B. Herman, and P. Sherline (1984), "In vivo and in vitro studies on the role of HMW-MAPs in taxol-induced microtubule bundling", Eur J Cell Biol, 33(1): p. 134-143.
22. Almeida, P.A. and V.N. Bolton (1995), "The effect of temperature fluctuations on the cytoskeletal organisation and chromosomal constitution of the human oocyte",
Zygote, 3(4): p. 357-365.
23. Aman, R.R. and J.E. Parks (1994), "Effects of cooling and rewarming on the meiotic spindle and chromosomes of in vitro-matured bovine oocytes", Biol Reprod, 50(1): p. 103-110.
24. Anchamparuthy, V. (2007), Vitrification of Bovine oocytes, Doctor of Philosophy in Animal Science, Blacksburg, Virginia.
25. Aono, N., T. Naganuma, Y. Abe, K. Hara, H. Sasada, E. Sato, and H. Yoshida (2003), "Successful production of blastocysts following ultrarapid vitrification with step-wise equilibriation of germinal vesicle-stage mouse oocytes", J Reprod Dev, 49(6): p. 501-506.
26. Applewhite A., W.M. (1995), "In vitro culture of bovine embryos in MBMOC and CR2 ", Theriogenology, 43(1): p. 160.
27. Arav, A., D. Shehu, and M. Mattioli (1993), "Osmotic and cytotoxic study of vitrification of immature bovine oocytes", J Reprod Fertil, 99(2): p. 353-358.
28. Arav, A., Y. Zeron, S.B. Leslie, E. Behboodi, G.B. Anderson, and J.H. Crowe (1996), "Phase transition temperature and chilling sensitivity of bovine oocytes",
Cryobiology, 33(6): p. 589-599.
29. Balaban, B., B. Urman, C. Alatas, R. Mercan, A. Mumcu, and A. Isiklar (2002), "A comparison of four different techniques of assisted hatching", Hum Reprod, 17(5): p. 1239-1243.
30. Bavister, B.D. (1995), "Culture of preimplantation embryos: facts and artifacts",
Hum Reprod Update, 1(2): p. 91-148.
31. Begin, I., B. Bhatia, H. Baldassarre, A. Dinnyes, and C.L. Keefer (2003), "Cryopreservation of goat oocytes and in vivo derived 2- to 4-cell embryos using the cryoloop (CLV) and solid-surface vitrification (SSV) methods",
Theriogenology, 59(8): p. 1839-1850.
32. Behalova, E., S.D. Smith, P. Hyttel, and T. Greve (1993), "Pronucleus formation in bovine oocytes activated by a single electric pulse", Reprod Nutr Dev, 33(5): p. 437-445. 33. Bernard A, F.B. (1996), "Cryopreservation of human oocytes: A review of current
problems and perspectives", Hum Reprod Update 2:193–207.
34. Birmingham, A. (2006), "Ovarian tissue and oocyte cryopreservation", The Practice Committee of the American Society for Reproductive Medicine and the Practice Committee of the Society for Assisted Reproductive Technology, 86 (4): p. S142: S147. 35. Black, M.M. (1987), "Taxol interferes with the interaction of microtubule-associated
proteins with microtubules in cultured neurons", J Neurosci, 7(11): p. 3695-702.
36. Bogliolo, L., F. Ariu, S. Fois, I. Rosati, M.T. Zedda, G. Leoni, S. Succu, S. Pau, and S. Ledda (2007), "Morphological and biochemical analysis of immature ovine oocytes vitrified with or without cumulus cells", Theriogenology, 68(8): p. 1138- 1149.
37. Boiso, I., M. Marti, J. Santalo, M. Ponsa, P.N. Barri, and A. Veiga (2002), "A confocal microscopy analysis of the spindle and chromosome configurations of human oocytes cryopreserved at the germinal vesicle and metaphase II stage", Hum Reprod, 17(7): p. 1885-1891.
38. Borovik, R., M. Steiner, J. Atad, B. Sneiderman, T. Rosenberg, and S. Palti (1998), "Taxol (paclitaxel) as second-line therapy in breast and ovarian cancer", Harefuah, 134(8): p. 605-8, 671.
39. Cetin, Y. and A. Bastan (2006), "Cryopreservation of immature bovine oocytes by vitrification in straws", Anim Reprod Sci, 92(1-2): p. 29-36.
40. Checura, C.M. and G.E. Seidel, Jr. (2007), "Effect of macromolecules in solutions for vitrification of mature bovine oocytes", Theriogenology, 67(5): p. 919-930. 41. Chen, C. (1986), "Pregnancy after human oocyte cryopreservation", Lancet,
1(8486): p. 884-886.
42. Chen, S.U., Y.R. Lien, K.H. Chao, H.N. Ho, Y.S. Yang, and T.Y. Lee (2003), "Effects of cryopreservation on meiotic spindles of oocytes and its dynamics after