2.3.6.1. Đánh giá theo hình thái
Sau khi giải đông, quan sát TBT dưới kính hiển vi đảo ngược hoặc kính soi nổi và tiến hành đánh giá tỉ lệ sống/chết của TBT:
TBT sống: màng tế bào còn nguyên vẹn, tế bào chất sáng đều và không bị
co, không bị phân mảnh.
TBT chết: màng tế bào bị tổn thương trong quá trình đông lạnh, nên tế bào chất bị co hoặc phân mảnh, màng tế bào có thể bị gãy.
2.3.6.2. Đánh giá theo nhuộm PI (propidium iodide)
Quy trình nhuộm theo Pike-See Cheah và cs. (2007), có cải biến [117].
Các TBT trưởng thành cần đánh giá sẽ được loại các tế bào cumulus xung quanh, sử dụng pipette Pasteur được kéo nhỏ ởđường kính khoảng 90-100µm. Các TBT đã loại sạch các tế bào cumulus được cốđịnh trong paraformaldehyde 4% (bổ
sung 1% BSA, 100mg/100 ml PVA) 40 phút, đặt trong tối ở 4oC. Sau đó, rửa lại 2 lần bằng dung dịch PBS (bổ sung 1% BSA, 100 mg/100ml PVA) và ủ trong dung dịch Triton X-100 0,1% qua đêm (10-12 giờ). Tiếp tục rửa lại 2 lần bằng dung dịch PBS (bổ sung 1% BSA, 100mg/100 ml PVA) cho sạch Triton X-100 và nhuộm trong PI nồng độ 30µg/ml trong 30 phút ở nhiệt độ phòng (25oC). Rửa các TBT đã
được nhuộm 2 lần trong PBS (bổ sung 1% BSA,100mg/100ml PVA) và cốđịnh lên lame. Các TBT trưởng thành sẽ bắt màu đỏ của thuốc nhuộm PI tại vùng NST và thể cực thứ nhất khi quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang ở bước sóng 535 nm (Hình 2.9). Trên hình ảnh nhuộm, NST còn nguyên vẹn là những vùng có hình hoa thị, sáng đều và thường nhỏ hơn thể cực; nếu NST bị tổn thương thì sẽ có hình ảnh các đốm sáng nằm rải rác hoặc không có NST.
Hình 2.9. Sơđồ bố trí thí quy trình nhuộm PI
2.3.6.3. Đánh giá theo nhuộm AO/PI
Quy trình nhuộm theo Pike-See Cheah và cs. (2007), có cải biến [117].
Tạo các vi giọt D-PBS trên đĩa Ф35, chia đĩa làm 2 phần (rửa và nhuộm), mỗi phần khoảng 6-7 vi giọt; Chuyển TBT cần nhuộm vào giếng chứa môi trường nuôi tương ứng với các thí nghiệm (N1 hoặc N2), loại bỏ sạch tế bào cumulus; Chuyển các TBT trần sang vi giọt D-PBS (phần rửa), rửa sạch các TBT trần rồi chuyển sang vi giọt D-PBS ở phần nhuộm. Bổ sung AO/PI (100µg/ml) vào vi giọt này, ủ trong 1 giờ, bọc giấy bạc để tránh ánh sáng; Rửa cho TBT sạch thuốc nhuộm bằng cách chuyển TBT qua các vi giọt D-PBS (phần rửa), mỗi lần rửa ủ 10 phút; Quan sát TBT trần bằng kính hiển vi huỳnh quang bước sóng 535 nm, đánh giá tỉ lệ
sống/chết: TBT sống là những TBT có màu xanh do thuốc nhuộm AO phát ra; TBT chết là những TBT có nhân màu cam, màu này chính là sự kết hợp giữa màu xanh do AO phát ra và màu đỏ do PI phát ra.
2.3.7. Phương pháp thụ tinh trong ống nghiệm
Thụ tinh trong ống nghiệm được thực hiện theo phương pháp của các nhà khoa học Nhật Bản (Japan Livestock Technology Association [76], có cải biến.
Bước 1: Chuẩn bị TBT
Chuẩn bị các vi giọt (100µl/vi giọt) môi trường BO bổ sung 10mg/ml BSA, có phủ dầu khoáng trong đĩa petri nhựa ɸ35mm để rửa các TBT trước khi cho vào vi giọt thụ tinh; chuẩn bị các vi giọt (100µl/vi giọt) môi trường IVM, N2 có phủ dầu khoáng trong đĩa petri nhựa ɸ35mm giữ các TBT trước khi cho vào vi giọt thụ tinh. (chuẩn bị ít nhất 2 giờ trước khi sử dụng, nhưng không quá 24 giờ).
Đối với các TBT MII được bảo quản lạnh bằng phương pháp thủy tinh hóa sẽ được giải đông (xem 2.3.5.1), đánh giá theo hình thái. Các TBT được cho là sống theo hình thái sau khi giải đông được nuôi trong vi giọt chứa môi trường nuôi IVM (TCM-199 + 10% FBS + 10ng/ml EGF + 0,2mM Natri pyruvate + 50µg/ml Gentamicin) khoảng 2-3 giờ trong tủấm ở điều kiện 38,5oC, 5% CO2, hơi nước bão hòa. Đối với các TBT GV được bảo quản lạnh bằng phương pháp thủy tinh hóa sẽ được giải đông (xem 2.3.5.1), đánh giá theo hình thái. Các TBT được cho là sống theo hình thái sau khi giải đông được nuôi trong vi giọt chứa môi trường nuôi N2 (tương ứng với môi trường khảo sát) khoảng 20-24 giờ trong tủ ấm ở điều kiện 38,5oC, 5% CO2, hơi nước bão hòa. Chọn các TBT chín để trong các vi giọt chứa môi trường nuôi cấy N2, chờ chuyển vào vi giọt thụ tinh. Cần tinh toán thời gian thích hợp để phù hợp với thời gian thực hiện IVF.
Chuẩn bị một lô thí nghiệm nuôi chín các TBT chưa qua đông lạnh đạt đến giai đoạn MII, để chuẩn bị IVF làm lô đối chứng. Tất cả các công đoạn này phải chuẩn bị trước khi chuẩn bị tinh trùng 1 giờ.
Bước 2: Chuẩn bị tinh trùng
Giải đông tinh trùng
Lấy 1-2 cọng rạ chứa tinh trùng khỏi bình nitơ lỏng, giữ trong không khí 5 giây. Giải đông cọng rạ trong nước ấm ở 35-37oC khoảng 30 giây. Sau đó, cắt một
đầu cọng rạ cho vào sát đáy ống falcon (loại 15ml), nhanh chóng cắt đầu còn lại và thổi nhẹđể chuyển toàn bộ tinh trùng vào đáy ống falcon.
Hoạt hóa tinh trùng
Tinh trùng sau khi giải đông được pha loãng và hoạt hóa trong môi trường BO (6ml) bổ sung sodium caffeine benzoate 0,3885 mg/ml và heparin 4 l/ml, sau đó li tâm lần thứ nhất 1800 vòng/phút trong 5 phút, hút bỏ phần trên, để lại phần dưới đáy khoảng 0,5 ml và huyền phù dịch này. Tiếp theo, tiến hành li tâm lần thứ hai với tốc
độ và thời gian như lần thứ nhất; phần lắng dưới đáy ống falcon được pha loãng bằng môi trường BO bằng cách cho thêm 0,5-0,8 ml dung dịch rửa tinh dịch (môi trường BO bổ sung sodium caffeine benzoate 0,3885mg/ml và heparin 4l/ml). Thể tích ban
đầu của dung dịch tinh trùng lúc này khoảng 0,6-0,8ml.
Kiểm tra sức đề kháng của tinh trùng bằng nước muối sinh lí 3% bằng cách hút 50µl dung dịch tinh trùng cho vào 4,95µl dung dịch nước muối sinh lí 3% và xác định mật độ tinh trùng bằng buồng đếm hồng cầu.
Điều chỉnh mật độ tinh trùng khoảng 25x106 tinh trùng/ml bằng cách thêm dung dịch pha loãng tinh trùng (môi trường BO bổ sung 20mg/ml BSA), tiếp tục pha loãng sao cho đạt mật độ 5-6x106 tinh trùng/ml (theo Otoi, 1998 [109]). Dịch huyền phù này dùng để tạo vi giọt thụ tinh trong đĩa 4 giếng (100µl/giọt), phủ dầu khoáng một phần vi giọt thụ tinh (500µl/giọt), giữ trong tủấm 38,5oC, 5% CO2.
Bước 3: Thụ tinh trong ống nghiệm
Các TBT đang được ủ trong các môi trường nuôi tương ứng sẽ được chuyển vào các vi giọt rửa TBT được chuẩn bị trong đĩa petri nhựa ɸ35mm. Chuyển 15-20 TBT chín vào mỗi vi giọt thụ tinh (có sẵn tinh trùng với thể tích 100µl/giọt) trong
đĩa 4 giếng có phủ dầu khoáng. Lưu ý, khi chuyển TBT, hút càng ít lượng môi trường nuôi TBT kèm theo thì càng tốt. Phủ dầu khoáng cho bao phủ hết vi giọt (thêm 500µl/giọt), đặt đĩa trên vào tủ nuôi ở 38,5oC; 5% CO2 trong 5-6 giờ. Sau đó, quan sát đánh giá kết quả thụ tinh.
2.3.8. Phương pháp nuôi phôi
Chuẩn bị các vi giọt chứa môi trường CR1aa bổ sung 5% FBS (100 µl/giọt), có phủ dầu khoáng (1ml) trong đĩa petri nhựa ɸ35mm tối thiểu 2 giờ trước khi sử
dụng, nhưng không quá 24 giờ.
Sau khi thụ tinh 5-6 giờ thụ tinh, các TBT được rửa sạch trong môi trường CR1aa bổ sung 5% FBS từ hai đến ba lần bằng mouth pipette sao cho loại bỏ được tế bào cumulus ra khỏi TBT. Các hợp tử giảđịnh được chuyển vào các vi giọt môi trường CR1aa bổ sung 5% FBS (100µl/giọt), đĩa nuôi được phủ dầu khoáng và nuôi
ở 38,5oC; 5% CO2. Sự phân chia của hợp tửđược đánh giá dựa vào sự phân chia tế
bào ở thời điểm 46-48 giờ sau thụ tinh. Tỉ lệ thụ tinh được tính dựa trên số phôi ở
giai đoạn 2 tế bào thay vì 2 tiền nhân.Sau 3 ngày nuôi cấy, tiến hành đánh giá tốc
độ phân chia: được xác định dựa trên số phôi phân chia trong số phôi/TBT trong một giọt nuôi cấy ban đầu. Thay môi trường nuôi phôi sau mỗi 48 giờ nuôi cấy, với thể tích 100µl/giọt, có phủ 1ml dầu khoáng. Theo dõi và đánh giá sự phát triển của phôi tại các mốc thời gian: 3-4 ngày nuôi cấy (phôi 8-16 tế bào); 5-6 ngày nuôi cấy (phôi dâu); 7-8 ngày nuôi cấy (phôi nang).
2.3.9. Phương pháp đông lạnh phôi
Phôi được đông lạnh chậm theo quy trình của Hasler (2002), có cải biến [61], [65] bằng máy đông lạnh tự động (Cryochamber, CC5S, Úc). Chỉ đông lạnh những phôi được tạo ra từ nguồn TBT MII bảo quản lạnh bằng phương pháp thủy tinh hóa.
Chuẩn bị dung dịch
Dung dịch 1: Môi trường PBS + 15% FCS Dung dịch 2: Môi trường PBS + 10% Glycerol
Tiến hành
Hút phôi vào cọng rạ
Phôi sau khi được đánh giá phân loại đạt tiêu chuẩn được rửa trong dung dịch 1 ít nhất 3 lần, tiếp theo chuyển phôi sang dung dịch 2 trong 5 phút và nạp phôi vào
cọng rạ (0,25ml, IMV, Pháp, 1 phôi/cọng rạ), hàn cọng rạ bằng máy ép (Hình 2.10),
để cân bằng trong cọng rạ 10 phút.
Hình 2.10. Cách hút phôi vào cọng rạ
Để tránh nhầm lẫn trong việc chọn phôi, trên cọng rạ phải ghi đầy đủ các thông tin như: giống bò, chất lượng phôi, giai đoạn phát triển của phôi.
Quy trình đông lạnh phôi
Đặt sẵn chương trình trên máy đông lạnh, khởi động máy trước. Sau khi cân bằng, đưa cọng rạ chứa phôi vào máy đông lạnh đã khởi động trước đang ở nhiệt độ
-7oC, giữ phôi 5-10 phút, tốc độ hạ nhiệt 1oC/phút. Tạo mầm đá bằng cách lấy pank và bông nhúng vào nitơ lỏng, sau đó kẹp vào phía đầu của cọng rạ (đầu có nút bấc), sau đó để vào máy 5 phút, nếu môi trường đã thành đá là quá trình tạo đá đã hoàn thành. Hạ nhiệt độ từ -7oC xuống -32oC với tốc độ 0,2-0,4oC/phút. Giữ phôi ở nhiệt
độ này khoảng 10 phút. Sau đó, chuyển cọng rạ có chứa phôi từ nhiệt độ -32oC vào thẳng nitơ lỏng (-196oC) bảo quản với thời gian mong muốn.
2.3.10. Phương pháp cấy truyền phôi
Phôi được cung cấp trong các cọng rạ (0,25ml), và chuyển giao cho cán bộ của Trung tâm Công nghệ Sinh học Tp. HCM, tổ chức thử nghiệm cấy truyền.
Lấy cọng rạ chứa phôi ra khỏi bình nitơ lỏng, để cân bằng trong không khí 5-6 giây, nhúng cọng rạ chứa phôi vào nước ấm 33oC đến khi toàn bộ tinh thểđá trong cọng rạ tan hết (khoảng 30 giây), dùng bông gòn tẩm cồn lau sạch cọng rạ, dùng kéo cắt phía đầu mối hàn của cọng rạ chứa phôi, chuyển vào môi trường giải đông
cọng rạ vào súng cấy phôi và cấy cho bò cái nhận phôi đã được gây động dục đồng pha trong khoảng 15 phút sau khi giải đông.
Sau khi cấy phôi từ 10-12 ngày, quan sát khả năng động dục trở lại (tránh nhầm lẫn hiện tượng động dục giả).
2.3.11. Phương pháp xử lí số liệu
Tất cả số liệu của luận án được xử lí theo các thuật toán xác suất thống kê trên máy vi tính bằng phần mềm Minitab 16, R và Analysis Toolpak trong MS-Excel 2010. Xác định giá trị trung bình và sai số trung bình của các kết quả thu được ở
mức ý nghĩa α < 0,05. Dùng hàm Chi-square test để kiểm định các tỉ lệ giữa các nghiệm thức.
CHƯƠNG 3
3.1. KẾT QUẢ NUÔI CHÍN TẾ BÀO TRỨNG TƯƠI TRONG ỐNG NGHIỆM
Các TBT được nuôi trong 3 môi trường IVM1, IVM2 và IVM3. Sau 22-24 giờ
nuôi cấy, các TBT được đánh giá sự trưởng thành thông qua sự giãn nở của lớp cumulus và sự xuất hiện của thể cực thứ nhất (Hình 3.1).
Hình 3.1. Tế bào trứng bò
(a) - thu từ buồng trứng (X10); (b) - chín theo độ giãn nở cumulus và (c) - có thể cực thứ nhất sau khi IVM (X20)
Các TBT khi mới thu nhận từ buồng trứng có lớp tế bào cumulus nén chặt, dày (Hình 3.1a). Sau 22-24 giờ nuôi cấy, các TBT được đánh giá chín theo độ giãn nở
(b)
(c)
cumulus, tế bào cumulus giãn nở rộng (Hình 3.1b). Sau khi loại bỏ cumulus, một số
TBT thấy có xuất hiện thể cực thứ nhất, một số khác chưa xuất hiện thể cực thứ
nhất nhưng vẫn chưa thấy dấu hiệu của sự thoái hóa (Hình 3.1c). Kết quả nuôi trưởng thành TBT được trình bày trong Bảng 3.1.
Bảng 3.1. Kết quả nuôi chín TBT trong ống nghiệm
Các loại môi trường nuôi Sốđợt TN Tổng số TBT đem nuôi Tỉ lệ (%) TBT chín IVM 1 10 2557 82,42 ± 0,73 (2085) IVM 2 10 980 82,24 ± 1,22 (806) IVM 3 6 2756 83,09 ± 0,71 (2290) P > 0,05
Tỉ lệ chín của TBT ở các môi trường IVM1 đạt 82,42 ± 0,73% (2085/2557); IVM2 đạt 82,24 ± 1,22% (806/980); IVM3 đạt 83,09 ± 0,71% (2290/2756). Nhìn chung tỉ lệ chín đạt từ82-83% và tương đối ổn định ở những lần thí nghiệm của cả
3 môi trường khảo sát (xem phụ lục 3, 1.1). Tỉ lệ chín của TBT ở cả 3 môi trường không có sự khác biệt (P > 0,05) (xem phụ lục 3, 1.1), như vậy, tỉ lệ chín của TBT khi nuôi ở 3 môi trường là tương đương nhau và chưa thấy ảnh hưởng của FCS và hCG lên kết quả nuôi chín TBT tươi. Ở môi trường IVM1, tiến hành loại bỏ
cumulus của 190 TBT chín theo sự giãn nở cumulus để khảo sát sự xuất hiện của thể cực thứ nhất. Kết quả có 154/190 TBT có thể cực, đạt tỉ lệ 81,05 ± 2,84%. Kết quả cho thấy tỉ lệ chín theo thể cực không có sự khác biệt so với tỉ lệ chín theo độ
giãn nở cumulus (P > 0,05) (xem phụ lục 3, 1.2). Như vậy, kết quả của chúng tôi
đánh giá tỉ lệ chín của TBT bò theo độ giãn nở cumulus và theo sự xuất hiện thể cực thứ nhất là tương đương, và tỉ lệ chín như vậy tương đối cao (> 80%).
BÀN LUẬN
Kết quả nuôi chín TBT của chúng tôi cao hơn các kết quả nghiên cứu trong nước: Nguyễn Hữu Đức (76,83%; 2003) [2], Nguyễn Văn Lý (65,61% và 71,19%; 2006) [5]; Phan Kim Ngọc (69,83%; 2009) [8]; và một số nghiên cứu được công bố
của nước ngoài: Yang và cs. (55,00%; 1998) [152], Morato và cs. (73,9%; 2008a) [103], Prentice (61,00%; 2010) [118]. Theo Yang và cs. (1998), Nguyễn văn Lý (2006), những TBT thu nhận từ các nang có đường kính từ 1-2mm làm giảm tỉ lệ
chín, từđó ảnh hưởng đến tỉ lệ nuôi; nếu thu các TBT từ các nang có đường kính từ
5-8mm cho tỉ lệ chín cao (84%) [5, 152]. Lonergan và cs. (1994) [90] cho rằng các TBT thu từ các nang có đường kính trên 6mm có khả năng phát triển tốt hơn so với các TBT thu từ các nang nhỏ hơn. Kết quả nuôi TBT chín của chúng tôi cao hơn có thể do chúng tôi thu nhận TBT từ những nang có đường kính từ 3-8mm, trong khi
đó các tác giả này thu nhận TBT từ các nang có đường kính từ 2-10mm. Mặt khác, chúng tôi đánh giá tỉ lệ chín của TBT tổng thể trên tất cả các nang thu được mà không phân chia thành các nhóm kích thước khác nhau.
Tuy nhiên, kết quả của chúng tôi vẫn còn thấp hơn một số nghiên cứu trên thế
giới: Saeki và cs. (90%; 1994) [125], Lonergan và cs. (87-97%; 1996 [89]), Morato và cs. (89,10%; 2008a) [103]. Sở dĩ các nghiên cứu này cho tỉ lệ chín của TBT cao là vì hầu như các tác giả này đều bổ sung EGF vào môi trường nuôi TBT. Theo các nghiên cứu đã công bố cho thấy EGF có vai trò kích thích sự giãn nở của tế bào cumulus và nâng cao tỉ lệ chín của TBT khi bổ sung với nồng độ thích hợp [1, 89]. Trong kết quả của chúng tôi, các môi trường được khảo sát đều có bổ sung 10ng EGF/ml, chính vì vậy tỉ lệ chín của TBT cũng được cải thiện. Ngoài ra, còn một số
Chất lượng và tính đồng đều của nguồn mẫu chưa cao
Các bò cái đưa vào các lò mổ được thu mua từ nhiều nguồn nên không có sự đồng đều về độ tuổi, cân nặng, di truyền. Mặt khác, những con bò này phần lớn là bò già, sức sinh sản yếu, thể trạng kém và buồng trứng có thể vàng tồn lưu lớn. Hình dáng buồng trứng thu được có nhiều buồng trứng xấu, không cân đối, dạng kéo dài có ít nang trứng và nhiều sẹo. Đôi khi, có một vài bò cái còn đang mang thai lớn. Vì vậy, chất lượng TBT chưa đảm bảo độđồng đều.
Thao tác thu nhận TBT
Theo các tài liệu công bố cho thấy, nếu chọc hút với lực quá mạnh sẽ làm ảnh hưởng đến sự liên kết giữa TBT và lớp cumulus, điều này không những làm tăng tỉ
lệ TBT loại C mà còn làm giảm chất lượng TBT. Cumulus tiếp xúc trực tiếp với