1.2.1. Khái niệm
Đông lạnh tế bào nói chung, đông lạnh TBT bò nói riêng là quá trình chuyển tế bào từ trạng thái sinh lí bình thường sang trạng thái tiềm sinh đông lạnh, bảo quản trong nitơ lỏng (nhiệt độ -196C). Tại điều kiện này, mọi hoạt động sống, các quá trình chuyển hóa và phát triển của TBT đều dừng lại, nhưng các cấu trúc và thành phần sinh học của chúng được bảo tồn, nhờ đó người ta có thể giữ TBT ở
trạng thái tiềm sinh trong một thời gian dài. Sau khi giải đông, mọi hoạt động sống của tế bào, các quá trình chuyển hóa… trở lại trạng thái bình thường [7, 24, 75].
1.2.2. Cơ chế sinh học lạnh của tế bào 1.2.2.1. Tốc độ làm lạnh và giải đông 1.2.2.1. Tốc độ làm lạnh và giải đông
Tốc độ làm lạnh (cooling rate)
Hỗn hợp các muối và các chất hòa tan khác có trong môi trường đông lạnh vẫn giữ nguyên trạng thái đông lạnh và tạo thành phần không đông. Tốc độ làm lạnh sẽ ảnh hưởng lớn đến khả năng khử nước và khả năng sống của tế bào sau giải đông [12, 65, 75, 118]. Nếu tốc độ làm lạnh quá nhanh, có thể tạo ra chênh lệch lớn về áp suất thẩm thấu giữa hai bên màng bào tương, làm tổn thương độ đàn hồi của màng. Ngược lại, nếu tốc độ làm lạnh quá chậm, tế bào có nhiều thời gian để khử nước, nhưng có thể bị mất nước quá nhiều, điều này cũng làm tổn thương màng tế bào. Tế
bào tiếp xúc với điều kiện áp suất thẩm thấu của môi trường ngoại bào cao, các muối, chất bảo vệ lạnh (cryoprotectant agents - CPA), các chất hòa tan khác trong thời gian dài có thể gây độc cho tế bào. Tính đàn hồi của màng tế bào cũng bị ảnh hưởng do tế bào ở trạng thái co nguyên sinh quá lâu [12, 65, 75, 118].
Tốc độ giải đông (warming rate)
Tốc độ giải đông phụ thuộc rất nhiều vào tốc độ làm lạnh tối ưu đã thực hiện với chính tế bào trước đó. Một số nghiên cứu trước đây cho thấy giải đông nhanh tế
bào động vật có vú sau khi bảo quản lạnh luôn tốt hơn, bởi vì các tế bào có thời gian ngắn để tái hình tinh thể đá và tiếp xúc với các chất bảo vệ trong thời gian ngắn hơn. Tuy nhiên, Whittingham và cs. (1977) đã chứng tỏ rằng có ngoại lệđối với quy luật này trên phôi chuột. Nghiên cứu này cho thấy các phôi được bảo quản bằng phương pháp làm lạnh chậm và giải đông với tốc độ chậm có sức sống tốt hơn [76, 118, 146].
Hiện nay, phương pháp phổ biến nhất để giải đông TBT sau khi được thủy tinh hóa là nhanh và trực tiếp. Thông thường TBT được đặt trong dung dịch giải
phải bị loại bỏ. Việc này được làm nhanh và cần thực hiện pha loãng từ từ qua từng bước
để tránh sự thay đổi áp suất thẩm thấu đột ngột, gây tổn thương cho tế bào [12, 118]. Tốc độ làm lạnh thực tế có thể đạt được cho trạng thái thủy tinh hóa xấp xỉ
2.500oC/phút [118], nhưng nếu sử dụng cọng rạ kéo mở (open-pulled straw - OPS) thì tốc độ làm lạnh có thểđạt tới 20.000oC/phút [12, 144]. Việc gia tăng tốc độđông lạnh và giải đông nhằm mục đích tránh sự hình thành tinh thểđá và giảm nồng độ
các dung dịch chất bảo vệ lạnh [96]. Khi đi qua các tế bào trong vùng nhiệt độ tới hạn (15 đến -5oC) một cách nhanh chóng, nước có thể di chuyển ra ngoài tế bào và
đóng băng bên ngoài tế bào. Chính điều này đã ngăn ngừa tổn thương lạnh đến các giọt lipid bên trong tế bào, lipid ở trong màng tế bào và bộ xương tế bào [62].
1.2.2.2. Những biến đổi trong quá trình đông lạnh
Sự hình thành tinh thểđá
Sự hình thành tinh thể
nước đá trong và ngoài tế
bào là yếu tố ảnh hưởng rất lớn đến sức sống của tế bào sau đông lạnh. Tốc độ làm lạnh chính là yếu tố quyết định dạng tinh thể nước đá hình thành. Khi làm lạnh với tốc độ thích hợp thì tinh thể nước đá hình thành có dạng sáu cạnh. Khi tốc độ
làm lạnh được đẩy lên thì hình dạng của nó sẽ là hình cây thông không đồng dạng và hình cầu (Hình 1.1) [12, 103, 112].
Khi tốc độ làm lạnh đạt đến 20.000oC/giây, nước nguyên chất tạo băng vô
định hình mà không có dạng tinh thể. Tuy nhiên, quá trình làm ấm trong giải đông
Hình 1.1. Ảnh hưởng của tốc độđông lạnh lên sự hình thành tinh thểđá và trạng thái của tế bào [13]
sẽ xảy ra quá trình tái tạo tinh thể nước đá từ nhỏđến lớn. Vì vậy, tốc độ nâng nhiệt chậm trong quá trình giải đông sẽ gây bất lợi cho tế bào [12, 103, 112].
Ở môi trường đẳng trương (áp lực thẩm thấu ở khoảng 300mOm/kg), tinh thể đá thường được hình thành ở nhiệt độ -5 đến -15oC. Tuy nhiên, tinh thểđá chỉ được hình thành ở nhiệt độ -10oC khi trong dung dịch có các phân tử chất rắn nhỏ. Nhiệt
độ càng giảm thì tinh thể đá càng tăng. Ở nhiệt độ khoảng -130oC, tất cả các chất liệu trong dung dịch đều ở dạng hạt kết tinh hay dạng thủy tinh. Quá trình này gọi là sự kết tinh hay hiện tượng thủy tinh hóa (vitrification) [12, 61, 103].
Sự khử nước
Sự khử nước của tế bào là rất cần thiết trong quá trình làm lạnh. Một khi tế
bào không được khử nước thì cấu trúc đá nội bào sẽ hình thành nếu nhiệt độ xuống dưới 0oC. Tốc độ khử nước của tế bào phụ thuộc vào nhiều yếu tố: tính thấm nước của màng, năng lượng hoạt hóa của tính thấm và tỉ lệ diện tích bề mặt/thể tích tế
bào (S/V). Những yếu tố này thay đổi tùy thuộc vào loại tế bào, vì vậy, chúng đóng vai trò quyết định trong việc xác định quá trình đông lạnh thích hợp nhất [12, 118].
Độ pH của dung dịch
Độ pH của dung dịch sẽ giảm theo nhiệt độ. Cân bằng acid - base của môi trường biến đổi theo hướng tăng lực ion, làm cho các phân tử protein hòa tan trong môi trường dễ bị kết tủa (salting out). Các chất bảo vệ đông lạnh với bản chất hóa học của nó giữ vai trò quan trọng trong việc kiểm soát biến đổi acid - base của dung dịch. Glycerol và các glycol hoạt động như những base yếu, trong khi DMSO lại hoạt động như những base mạnh. Độ pH thích hợp nhất để duy trì hoạt động sinh lí của tế bào phụ thuộc vào nhiệt độ mà tế bào được bảo quản. Người ta nhận thấy rằng, sự sống có thể tồn tại sau bảo quản ở các nhiệt độ xấp xỉ 0oC với độ pH lớn hơn 9 [12, 75, 118].
Sự hình thành bọt khí
Trong quá trình bảo quản lạnh, tế bào bị tổn thương và có thể chết vì nhiều cách khác nhau do sự hình thành tinh thểđá. Thể tích nước bị đông lạnh sẽ tăng lên (tỉ trọng của nước đá thấp hơn tỉ trọng của nước) dẫn đến việc bọt khí có thể hình thành khi nhiệt độ giảm xuống. Kích thước của bọt khí thay đổi từ 25-100µm và tỉ
lệ nghịch với tốc độ làm lạnh, trong khi số lượng bọt khí tỉ lệ thuận với tốc độ làm lạnh [12, 75, 118].
Bên cạnh các khí hòa tan theo nồng độ, môi trường nuôi cấy còn sử dụng CO2 làm đệm nhằm cân bằng acid - base. Khi làm lạnh thì các khí này không còn ở dạng hòa tan mà tách ra thành những bọt khí có khả năng gây tổn thương cho tế bào. Khi tiến hành giải đông, bọt khí có thểđược hình thành và có thể phát triển thành không bào rất lớn trong nội bào, làm tế bào phồng to quá mức và có thể bị phá hủy hoàn toàn. Sự tạo thành bọt khí xảy ra nhiều trong môi trường sử dụng đệm bicarbonate, vì vậy, sử dụng môi trường PBS (Phosphate-buffered saline) có thể hạn chế số lượng bọt khí [12, 75, 118].
1.2.2.3. Những tổn thương trong quá trình đông lạnh
Trong quá trình bảo quản lạnh, mức độ tổn thương phát sinh trong các tế bào chủ yếu phụ thuộc vào kích thước, hình dạng của tế bào, tính thấm của màng tế bào và chất lượng (cấp độ) của tế bào. Các yếu tố này thay đổi giữa các loài, giai đoạn phát triển và nguồn gốc của chúng [139]. Đã có các bê con được sinh ra từ các TBT
đông lạnh - giải đông ở nhiều loài, nhưng khả năng để hỗ trợ cho sự phát triển phôi sau quy trình bảo quản lạnh thường thấp. Nguyên nhân được cho là do những tổn thương của TBT sau khi bảo quản lạnh [42]. Ngoài ra, màng tế bào chất của TBT rất khác biệt (differ drastically) so với màng của phôi [106]. Trong quá trình phát triển phôi, sự tập trung các sợi actin được polyme hóa dạng màng tăng lên và hình dạng (cấu tạo, comformation) của nó thay đổi. Điều này tạo điều kiện cho việc thấm nước và các chất bảo vệ lạnh, đồng thời thúc đẩy sự mất nước và làm giảm sự hình thành tinh thể đá nội bào trong suốt các quá trình bảo quản lạnh. Thêm vào đó,
màng tế bào của phôi tăng sức chịu đựng thẩm thấu trong suốt quá trình giải đông và cho phép phôi chịu được sựđông lạnh và giải đông tốt hơn TBT [42]. Ngoài ra, các giai đoạn phát triển của TBT tại thời gian bảo quản lạnh được cho là ảnh hưởng
đến các đặc tính sinh học lạnh của tế bào [115].
Cơ chế phân tử đặc trưng làm đứt gãy trong quá trình đông lạnh chưa được hiểu rõ, nhưng các yếu tố siêu cấu trúc để duy trì và phát triển về sau bị tổn thương [135]. Các TBT sau khi giải đông thường bị đứt gãy màng trong suốt và màng TBT. Khi TBT được làm lạnh từ 37oC xuống 20oC hoặc dưới 20oC thường dẫn đến có nhiều biến đổi về cấu trúc tế bào và nhiễm sắc thể, nhưng trong một số trường hợp, tế bào có khả năng tự sửa chữa toàn bộ hoặc một phần [95, 139]. Những tác dụng ngược chủ yếu trong suốt quá trình bảo quản lạnh là do sự hình thành tinh thể nước
đá, tổn thương thẩm thấu, các hiệu ứng độc của các chất bảo vệ lạnh, các chất điện giải bên trong tế bào cô đặc, tổn thương lạnh, đứt gãy màng và những biến đổi của các bào quan bên trong tế bào, sự tiếp xúc giữa tế bào với tế bào [94, 137]. Các giải pháp để vượt qua những hậu quả này bao gồm giảm thể tích vật mang, gia tăng gradient nhiệt, thay đổi tỉ lệ diện tích/thể tích tế bào và thêm vào các chất như: các protein chống đông, đường, các chất chống oxi hóa làm ổn định màng tế bào trong suốt quá trình đông lạnh; đồng thời gia tăng sự dung nạp lạnh (cryotolerance) [85, 115].
Các giai đoạn phát triển của TBT tại thời điểm bảo quản lạnh cũng ảnh hưởng
đến đặc tính sinh học lạnh của tế bào. Một số nghiên cứu cho thấy việc đông lạnh TBT GV là một ý tưởng hay do không có sự hiện diện của thoi vô sắc trong quá trình giảm phân và vật liệu di truyền được giáp với nhân. Tuy nhiên, TBT GV thường có độ nhạy cao với “stress” trương lược không đều và tính ổn định của màng tế bào thấp hơn TBT MII [18, 36, 85, 101]. Bảo quản lạnh TBT GV dưới 4oC làm giảm sự hình thành các thoi vô sắc giảm phân bình thường và giảm sự thụ tinh. Một giả thuyết khác cho rằng bào quản lạnh TBT GV làm tổn thương đến cấu trúc toàn vẹn của màng nhân, ảnh hưởng đến sự sao chép, phiên mã của DNA và chức năng của tế bào, tuy nhiên, nhân có khả năng ráp lại (reassemble) sau khi giải đông
tính toàn vẹn về cấu trúc và chức năng của COC (cumulus–oocyte complex). Các tổn thương về tế bào cumulus bao quanh TBT cũng ảnh hưởng đến sự thành công trong bảo quản lạnh TBT GV. Khe nối giữa TBT và cumulus đóng vai trò quan trọng trong sự chín trưởng thành của TBT vì có cung cấp các chất dinh dưỡng trong quá trình IVF [95]. Đã có nghiên cứu chứng minh rằng khi TBT không còn cumulus thì khả năng trưởng thành nhân và tế bào chất là rất thấp [36, 44, 67].
Đối với TBT MII, những thay đổi xảy ra ở màng bào tương làm ảnh hưởng
đến tính thấm nước và các chất bảo vệ lạnh. Khi TBT tiếp tục giảm phân lần thứ
nhất, màng nhân biến mất, cho phép vật chất di truyền hòa vào tế bào chất. Lúc này có những biến đổi về sự tổ chức của nhân và sự phân bố của các bào quan: ti thể, cấu trúc tế bào và các hạt vỏ, chính điều này cũng góp phần ảnh hưởng đến kết quả
của kĩ thuật bảo quản lạnh. Thêm vào đó, các tế bào cumulus bao quanh TBT bị
giãn nở, các vi sợi của actin cần phải thay đổi hình dạng tế bào và sự chuyển động, các vi ống được hình thành từ thoi vô sắc [95].
Sự thụ tinh thành công phụ thuộc vào việc duy trì được tính toàn vẹn về cấu trúc và chức năng của các phức hợp COC. Mặc dù ảnh hưởng của tế bào cumulus lên sự sống sót của TBT sau đông lạnh và giải đông được tranh luận nhiều, nhưng những tác động có lợi đã được báo cáo (Imoedemhe và cs., 1992 [74], Im và cs., 1997 [73]). Theo các tác giả này, sự hiện diện của tế bào cumulus có thể tạo sự bảo vệ chống lại sự thay đổi áp suất thẩm thấu và stress. Sự thay đổi áp suất thẩm thấu và stress được gây ra bởi sự di chuyển vào hoặc ra một cách nhanh chóng của các chất bảo vệ lạnh trong suốt quá trình cân bằng và loại bỏ chất bảo vệ khi giải đông. Tuy nhiên, việc bảo quản lạnh phức hợp trứng - cumulus nguyên vẹn còn là một vấn
đề bởi vì thời gian tối ưu cho việc cân bằng tương đối khác nhau giữa TBT hơn là các tế bào cumulus. Ngoài ra, TBT nằm trong dung dịch bảo vệ ưu trương làm tế
bào co lại, điều này có thể gây nên sự phá vỡ liên kết giữa tế bào cumulus và TBT, vì vậy, tương tác lí sinh giữa TBT và tế bào dinh dưỡng bao quanh không còn đảm bảo (Fuku và cs., 1995 [55]; Gosden, 2005 [62]). Chính vì vậy, khi TBT MII tiếp
xúc với các chất bảo vệ lạnh và nhiệt độ thấp có thể làm tổn thương đến thoi vô sắc, sợi actin; cản trở sự hoạt động của NST và sự tái trùng hợp của vi ống [95].
TBT có độ nhạy rất cao khi làm lạnh, có thể bị tổn thương ngay cả khi ở nhiệt
độ phòng. Một phần chính là do thoi vô sắc mỏng manh và trong tế bào chứa hàm lượng lipid cao. TBT là tế bào duy nhất mà DNA của giao tử cái được treo trên thoi vô sắc trong tế bào chất khi phân bào giảm nhiễm và không được màng nhân bảo vệ. Những tổn thương của DNA và các vi ống làm hạn chế thành công của sự bảo quản lạnh TBT. Khi TBT bò bị tổn thương ở nhiệt độ phòng thì khả năng sống giảm
đáng kể và hệ thống thoi vô sắc giữ các nhiễm sắc thể bị đứt gãy (disassembled) (Saunders và Parks, 1999 [127]; Wu và cs., 1999 [148]) và chromatid có thể không phân chia trong quá trình làm lạnh, dẫn đến hình thành đa bội thể (Eroglu và cs., 1998 [52]) hoặc dị bội thể (Sathananthan và cs., 1987 [126]) sau khi thụ tinh.
1.2.3. Các phương pháp đông lạnh tế bào trứng
Có hai phương pháp đông lạnh hiện nay được sử dụng là: đông lạnh cân bằng (equilibrium cooling) hay còn gọi là đông lạnh chậm (slow freezing) và đông lạnh không cân bằng (non – equilibrium cooling) còn được gọi là đông lạnh cực nhanh (thủy tinh hóa, vitrification). Sự lựa chọn phương pháp đông lạnh phụ thuộc vào một số yêu cầu như: (1) tính hiệu quả, (2) tính an toàn, (3) tính tiện lợi [7, 24].
1.2.3.1. Đông lạnh chậm (Slow-cooling)
Đông lạnh chậm sử dụng chất bảo vệ lạnh (Cryoprotectant agents - CPA) với nồng độ thấp (khoảng 1-2M) thêm vào môi trường đông lạnh, tốc độ làm lạnh giới hạn khoảng 0,1-1,0oC/phút). Quá trình làm lạnh thực hiện nhờ các máy giảm nhiệt, các tế bào được khử nước với tốc độ chậm [24].
Trước khi giảm nhiệt độ tế bào xuống dưới 0oC, TBT sẽđược tiếp xúc với môi trường có CPA với nồng độ thấp (khoảng 1-1,5M/lít) để làm mất nước nội bào nhằm hạn chế sự hình thành tinh thể đá. Thường trong giai đoạn này, người ta chỉ
sự dụng một loại CPA (propanediol - PROH, DMSO hay EG). Do tính thấm qua màng tế bào của nước cao hơn của CPA, nên sự di chuyển của nước ra khỏi tế bào nhanh hơn sự di chuyển của CPA vào tế bào. Chính điều này làm cho tế bào ban
đầu bị giảm thể tích, sau đó phục hồi dần thể tích [12, 24].