Trong điều kiện in vitro với môi trường chứa dịch muối cân bằng, các cơ chất cung cấp năng lượng, protein, điều kiện môi trường 5%CO2 và ở nhiệt độ 38,5oC, TBT bò sau
khi thụ tinh vẫn có Hình 1.3. Các giai đoạn phát triển của phôi [1]
khả năng phát triển bình thường. Sau khi thụ tinh, phôi phân chia bằng cách nguyên phân liên tục, tạo thành các tế bào phôi. Sự phát triển của phôi tạo ra trong điều kiện
in vitro cũng như phôi in vivo (Hình 1.3) [24].
Có nhiều hệ thống đánh giá phôi sau khi thụ tinh, thường tiêu chuẩn hình thái
được sử dụng để đánh giá chất lượng của phôi bao gồm: số lượng tế bào phôi; kích thước, hình dạng, sựđối xứng, màu sắc bào tương của các tế bào phôi; tỉ lệ xuất hiện các mảnh vỡ tế bào trong bào tương. Hiện nay, các nghiên cứu ở phòng thí nghiệm chủ yếu đánh giá phôi qua hình thái [61].
1.9. MÔI TRƯỜNG DÙNG CHO THỤ TINH TRONG ỐNG NGHIỆM Ở TẾ
BÀO TRỨNG BÒ
Môi trường TALP (Tyrodes Albumin Lactate Pyruvate) sử dụng BSA làm nguồn protein. Năm 1994, Saeki và cs. công bố, các TBT không có COC khi IVF trong môi trường TALP có bổ sung BSA cho tỉ lệ thụ tinh đạt 89% so với 6% ở môi trường TALP không bổ sung BSA [125]. Năm 2000, Pavlok báo cáo, các tế bào hạt có khả năng kéo dài thời gian thụ tinh (fertile lifespan) của tinh trùng bò sau khi bảo quản lạnh/rã đông. Phát hiện này rất hữu ích trong việc cải thiện thụ tinh trong ống nghiệm ở gia súc khi tinh trùng có sức sống thấp [61, 114].
Môi trường dịch ống dẫn trứng tổng hợp (Synthetic Oviductal Fluid - SOF)
được cho là môi trường đơn giản cho việc nuôi phôi của gia súc. Dịch ống dẫn trứng và dịch tử cung của động vật có vú chứa nồng độ cao các acid amin tự do bao gồm alanine, asparagine, glycine, serine và taurine [1, 61]. Acid amin có một vai trò sinh lí của sự phát triển phôi động vật có vú ở giai đoạn trước làm tổ (Gardner và Lane, 1993) [59]. Năm 1991, Fukui và cs. đã báo cáo rằng SOF với 5% oxy và FCS là môi trường tốt nhất để phôi phân chia và phát triển đến giai đoạn phôi nang [56]. Theo Edward và cs. (1997), khi dùng môi trường SOF có acid amin để nuôi phôi bò, có khoảng 50% TBT thụ tinh đã phát triển đến giai đoạn phôi nang chỉ sau 6 ngày nuôi [50]. Năm 1999, Lonergan và cs. đã chứng minh rằng khi nuôi phôi trong môi trường SOF với nồng độ oxy là 5%, có bổ sung cả BSA và FCS đã cải thiện
đáng kể tỉ lệ phát triển của phôi [91]. Lazzari và các cs. (1999) đã báo cáo về việc sử dụng môi trường SOF có bổ sung các acid amin thiết yếu (essential amino acids -
EAA), các acid amin không thiết yếu (non-essential amino acids - NEAA),
glutamine và glycine thu được chất lượng phôi phát triển vào ngày thứ 7 tốt hơn so với môi trường TALP. Nhóm nghiên cứu này cho rằng môi trường SOF không có glucose là môi trường phù hợp cho việc thụ tinh trong ống nghiệm ở gia súc [61].
Hệ thống nuôi cấy không có huyết thanh (Serum-free culture systems) thường dùng nuôi cấy phôi bò. Theo Rosenkrans và First (1991), khi sử dụng môi trường
đơn giản không có huyết thanh, Charles Rosenkrans 1 (CR1), chứa các acid amin thay thế và không thay thế có lợi cho phôi bò phát triển in vitro [123]. Thompson và cs. (1992) đã báo cáo rằng acid amin không thay thế trong môi trường SOF không có huyết thanh đã làm tăng đáng kể phôi nang và số phôi bào, có thể so sánh với phôi phát triển trong môi trường SOF bổ sung albumin huyết thanh người [136]. Năm 1997, Damiani và cs. (ở Mỹ) nhận thấy rằng việc loại bỏ huyết thanh trong giai đoạn phát triển sớm không ảnh hưởng đến sự phát triển của phôi và tỉ lệ mang thai sau khi phôi được cấy truyền [45]. Theo Abe và cs. (1999), việc nuôi trong môi trường không huyết thanh có thể tạo ra một số lượng phôi phù hợp hơn cho việc bảo quản lạnh và cấy truyền phôi [15]. Đến năm 2002, Abe và cs. phát hiện việc nuôi phôi bò trong môi trường không huyết thanh thường tập trung các giọt lipid bất thường trong tế bào chất. Khi lượng lipid quá mức có ảnh hưởng đến việc bảo quản phôi. Họ cũng phát hiện ra các giọt lipid khi nuôi trong môi trường có huyết thanh lớn hơn nhiều so với trong môi trường không có huyết thanh (2-6µm so với < 2µm, tương ứng) [14]. Nhìn chung, phôi của động vật có vú tạo ra trong ống nghiệm có thể phát triển đến giai đoạn phôi dâu/phôi nang trong các môi trường có thành phần hóa học xác định mà không bổ sung thêm bất kỳ loại huyết thanh nào hay các yếu tố
có từ tế bào ống dẫn trứng [1, 61, 76].
Môi trường BO (Brackett-Oliphant) được xem là môi trường cơ bản dùng để
CR1aa để nuôi phôi. Trong những năm gần đây, một số nhà khoa học đã sử dụng môi trường BO làm môi trường thụ tinh, và môi trường CR1aa để nuôi phôi. Họđã thu được tỉ lệ thụ tinh khá cao đạt 50,67% ở TBT tươi (Nguyễn Văn Lý, 2006), 48,83% (Phan Kim Ngọc và cs., 2009), 73% (Prentice, 2010). Tỉ lệ phôi phát triển
đến giai đoạn phôi nang đạt 30,12% (Nguyễn Văn Lý, 2006), 18,01% (Phan Kim Ngọc và cs., 2009), 22% (Prentice 2010) [5, 8, 118].
Môi trường đồng nuôi cấy với tế bào ống dẫn trứng bò (Co-culture with bovine oviductal cells) đã khắc phục được sự phát triển của phôi vượt qua giai đoạn 8-16 tế bào. Tuy nhiên, môi trường đồng nuôi cấy cho kết quả vẫn thấp hơn so với trong cơ thể. Rief và cs. (2002) đã dùng hệ thống nuôi cấy cơ bản bởi lớp đơn BOEC (Bovine Oviduct Epithelial Cell - tế bào biểu mô ống dẫn trứng bò) trong môi trường SOF bổ sung 5% huyết thanh bò động dục (oestrous cow serum - OCS), nhóm này nhận thấy môi trường này có lợi cho việc thiết lập nên một mô hình trong
ống nghiệm để nghiên cứu sự phát triển của phôi ở giai đoạn sớm: như sự trao đổi chất và năng lượng của các gen được chọn lựa về khả năng phát triển [121]. Xia và cs. (1995) nhận thấy cách nuôi cấy với lớp đơn ống dẫn trứng có thể hỗ trợ sự phát triển phôi bò giai đoạn sớm, nhưng để duy trì tỉ lệ phát triển đến giai đoạn phôi nang cao thì cứ mỗi 2-3 ngày phải được thay sạch môi trường nuôi cấy [149]. Applewhite và Westhusin (1995), báo cáo rằng có nhiều phôi phát triển đến giai
đoạn phôi dâu/nang hơn khi bổ sung tế bào BOEC vào môi trường nuôi cấy [26]. Mishra và cs. (1999) cho rằng BOEC chứa thụ thể LH - có chức năng làm gia tăng sự tổng hợp glycoprotein của ống dẫn trứng, chính yếu tố này làm tăng sự phát triển giai đoạn sớm của phôi lên giai đoạn phôi nang [102]. Tavares và cs. (2000) tiến hành nuôi cấy các hợp tử trong môi trường TCM-199 bổ sung các tế bào ống dẫn trứng bò hoặc các tế bào hạt, kết quả chưa thấy có sự khác biệt về tỉ lệ phôi nang giữa các môi trường [134]. Việc đồng nuôi cấy với các tế bào ống dẫn trứng đã làm tăng tỉ lệ phát triển của phôi in vitro của gia súc ở giai đoạn đầu. Tuy nhiên, cơ chế
tác động của các tế bào ống dẫn trứng trong quá trình nuôi vẫn chưa rõ. Người ta
lượng đặc biệt giúp cho sự phát triển của phôi. Hiện nay vẫn còn nhiều nghiên cứu về cơ chế tác động của các tế bào ống dẫn trứng lên sự phát triển của phôi gia súc
được tạo ra trong ống nghiệm.
1.10. NHẬN ĐỊNH CHUNG VỀ VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU BẢO QUẢN LẠNH TẾ BÀO TRỨNG
Việc bảo quản nguồn gen của động vật đang là vấn đề chung của toàn cầu. Việc phát triển một quy trình chuẩn mực cho mỗi loại tế bào đang được nhiều nhà khoa học quan tâm, nghiên cứu. Bảo quản lạnh TBT là một bước quyết định cho việc bảo tồn nguồn gen của con cái. Mặc dù trải qua nhiều thập niên nghiên cứu, bảo quản lạnh TBT vẫn còn là một thách thức đối với mỗi loài do cấu trúc phức tạp của TBT. Có hai vấn đề chính hạn chế sự thành công của đông lạnh TBT là tỉ lệ sống và tỉ lệ thụ tinh thấp. Đông lạnh chậm thông thường cho tỉ lệ sống đạt từ 50- 60% do sự hình thành tinh thểđá nội bào [34]. Các tinh thểđá chính là nguyên nhân gây tổn thương đến TBT [34, 70].
Trong vài năm qua, các phương pháp đông lạnh chậm cải biến đã cải thiện
được tỉ lệ sống của TBT sau đông lạnh/giải đông, tuy nhiên, tỉ lệđậu thai còn thấp (10 - 20%). Phương pháp thủy tinh hóa là một phương pháp đơn giản, ít tốn kém. Phương pháp thủy tinh hóa tránh được sự tổn thương thoi vô sắc trong giảm phân và tỉ lệ sống trên 80% [82]. Ở một số động vật, phương pháp thủy tinh hóa cho thấy những bất thường về nhiễm sắc thể, hiện tương đa bội lẻ thấp hơn so với đông lạnh chậm trước đây [69, 70]. Dù các nhà khoa học đã nỗ lực nghiên cứu trong nhiều năm qua, nhưng thủy tinh hóa vẫn chưa tạo ra kết quả thuyết phục để có thể áp dụng rộng rãi. Điều quan trọng là các nhà nghiên cứu phải đạt được những kết quả phù hợp và thiết lập được một quy trình phổ biến có thể áp dụng cho việc quản lạnh TBT ở các giai đoạn khác nhau.
CHƯƠNG 2
2.1. VẬT LIỆU
TBT bò thu nhận từ buồng trứng bò cái tại lò giết mổ gia súc thuộc công ty Kỹ nghệ
Vissan vàcơ sở giết mổ gia súc Thành Vinh. Tinh trùng sử dụng trong thí nghiệm là tinh trùng đông lạnh trong cọng rạ 0,25ml, giống Holstein Friesian (Mỹ) và giống Clovis (Pháp).
Các thí nghiệm IVM, đông lạnh TBT, IVF được thực hiện tại Phòng thí nghiệm Nghiên cứu và Ứng dụng Tế bào gốc, Trường Đại học Khoa học Tự Nhiên TP. HCM.
- Hóa chất
TCM-199 (M3769, Sigma), FBS (Gibco), FCS (Gibco), Gentamicin (Canada), IVF Flushing (Vitrolife, Thụy Điển), dầu khoáng (Merck), Hyaluronidase (H4272, Sigma), Taxol (Sigma), dung dịch Tyrode (T1788, Sigma), Natri pyruvate (Sigma),
AO/PI (Sigma). Cách pha các môi trường xem Phụ lục 1.
- Dụng cụ
Đĩa Petri d = 90mm, 60mm (Corning, Mỹ), đĩa 4 giếng (Nunc, Đức), kim 18G, syringe 5ml, gạc vô trùng, pipette Pasteur kéo đường kính 120μm, mouth pipette, cọng rạ 0,25ml (IMV, Pháp), máy ép nhựa, bình đựng nitơ lỏng, một số dụng cụ
thủy tinh: bercher, erlen…
- Thiết bị
Water bath (Memmert, Đức), kính hiển vi đảo ngược (Olympus, Nhật), kính hiển vi đảo ngược phản pha huỳnh quang (Olympus, Nhật), kính hiển vi soi nổi (độ
phóng đại tối đa 400 lần, Nikon, Nhật), tủ ấm CO2 (Sanyo, Nhật), máy đông lạnh phôi tựđộng (Cryochamber, CC5S, Úc)
Các loại thiết bị, dụng cụ chuyên dụng (Phụ lục 2)
2.2. BỐ TRÍ THÍ NGHIỆM
Toàn bộ thí nghiệm trong luận án được bố trí theo sơđồ Hình 2.2.
2.2.1. Nội dung 1: Nuôi chín tế bào trứng tươi trong ống nghiệm
Ảnh hưởng của FCS và hCG lên IVM tế bào trứng tươi
Thí nghiệm được chia thành 3 lô, tương ứng với 3 môi trường nuôi chín (IVM1, IVM2 và IVM3), kết quả nuôi chín phục vụ cho đông lạnh TBT MII. Nội dung 1
được bố trí theo Bảng 2.1. Bảng 2.1. Bảng bố trí thí nghiệm nội dung 1 Môi trường nuôi Số lần lặp lại Số TBT đem nuôi Mục đích thí nghiệm IVM1 10 2.557 ĐL theo quy trình 1, phục vụ IVF
IVM2 10 980
ĐL theo quy trình 2 và 3, đánh giá chất lượng TBT sau đông lạnh, giải
đông qua hình thái và nhuộm PI
IVM3 6 2.756 ĐL theo quy trình 2 và 3, phục vụ IVF
Ở môi trường IVM1, lấy ngẫu nhiên 190 TBT/10 lần đem loại bỏ
2.2.2. Nội dung 2: Đông lạnh, giải đông tế bào trứng chín (TBT MII)
Ảnh hưởng của FCS, Taxol và dung dịch acid Tyrode lên TBT MII đông lạnh
Bảng 2.2. Bảng bố trí thí nghiệm nội dung 2 Lô TN Số lần lặp lại Số TBT đông lạnh Mục đích QT1 (cơ bản) 10 1.404 IVF QT2 (cải tiến 1) QT2(1) 10 412 Đối chứng cho QT3(1) QT2(2) 6 938 IVF đối chứng cho QT3(2) QT3 (cải tiến 2) QT3(1) 10 317 Khảo sát nhuộm PI QT3(2) 6 968 IVF Cơ bản: không có FCS; cải tiến 1: cơ bản + 5% FCS; cải tiến 2: cải tiến 1 + 1µM Taxol
2.2.3. Nội dung 3: Thụ tinh trong ống nghiệm từ các tế bào trứng MII đông lạnh
Thí nghiệm được chia thành 2 lô, cụ thể theo Bảng 2.3:
Bảng 2.3. Bảng bố trí thí nghiệm nội dung 3
Lô TN Số TBT thực
hiện IVF Nguồn gốc TBT 1
TN1 781 Đông lạnh theo QT1
ĐC1 316 Chưa qua đông lạnh (tươi)
2
TN2 578 Đông lạnh theo QT3 (cải tiến 2)
ĐC2 528 Đông lạnh theo QT2 (cải tiến 1)
2.2.4. Nội dung 4: Thử nghiệm cấy truyền phôi tạo ra từ các tế bào trứng MII
đông lạnh
Bảng 2.4. Bảng bố trí thử nghiệm nội dung 4
Số phôi cấy truyền Giai đoạn phôi cấy truyền Số bò nhận phôi
32 Dâu và nang 23
2.2.5. Nội dung 5: Đông lạnh, giải đông tế bào trứng GV
Thí nghiệm chia thành 2 đợt, mỗi đợt dùng 2 phương thức đông lạnh: đông lạnh dùng cọng rạ (2.288 TBT) và đông lạnh bằng vi giọt (2.151 TBT). Đánh giá TBT sống sau đông lạnh giải đông theo hình thái sau đó nhuộm AO/PI, cụ thể theo Bảng 2.5. Bảng 2.5. Bảng bố trí thí nghiệm nội dung 5 Đợt TN Số lần lặp lại Cọng rạ Vi giọt Mục đích Số TBT ĐL Số TBT nhuộm Số TBT ĐL Số TBT nhuộm 1 8 760 0 723 0 Khảo sát tỉ lệ sống chết của TBT sau khi
đông lạnh/giải đông theo hình thái và theo nhuộm AO/PI
2 6 1528 186 1428 180
2.2.6. Nội dung 6: Nuôi chín tế bào GV sau khi được bảo quản lạnh
Thí nghiệm được chia thành 2 đợt, cụ thể trong Bảng 2.6.
Bảng 2.6. Bảng bố trí thí nghiệm nội dung 6 Đợt TN Môi trường Lô TN Số lần lặp lại Số TBT đem nuôi Mục đích 1 N1 CR 6 235 - Khảo sát môi trường nuôi chín TBT (N1, N2) - Khảo sát vật mang (CR, VG) VG 6 261 ĐC1 6 139 N2 CR 6 233 VG 6 263 ĐC2 6 136 2 N2 CR 6 861 Dùng cho IVF VG 6 868 ĐC2 6 180 N1: Cơ bản; N2: cải tiến của N1(N1 + 10% dịch nang trứng); CR: cọng rạ; VG: vi giọt; ĐC: đối chứng; IVF: thụ tinh trong ống nghiệm
2.2.7. Nội dung 7: Thụ tinh trong ống nghiệm từ các TBT GV đông lạnh được nuôi chín in vitro nuôi chín in vitro Bảng 2.7. Bảng bố trí thí nghiệm nội dung 7 Lô TN Số lần lặp lại Số TBT đem thụ tinh Cọng rạ 6 179 Vi giọt 6 111 Đối chứng 6 123
2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.1. Phương pháp thu buồng trứng và tế bào trứng
Buồng trứng được thu nhận theo phương pháp của Gordon (2003) [61], Cetin (2006) [39], Kim (2007) [79]. Thu nhận buồng trứng từ bò cái vừa giết mổ, loại các mô mỡ và rửa sạch bằng nước muối sinh lí đã bổ sung kháng sinh Gentamicin (50µg/ml). Buồng trứng được chuyển mẫu về phòng thí nghiệm (PTN) trong dung dịch nước muối sinh lí 35-37oC có bổ sung kháng sinh (từ 3-5 giờ sau khi con vật bị giết mổ).
Tại PTN, mẫu buồng trứng được xử lí sơ bộ, rửa 2-3 lần bằng dung dịch NaCl 0,9% bổ sung kháng sinh đã làm ấm 37oC rồi chuyển vào tủ cấy vô trùng, tiếp tục rửa buồng trứng từ 2-3 lần nữa (Hình 2.3a). Dùng gạc vô trùng lau khô buồng trứng rồi chuyển vào becher chứa D-PBS có bổ sung kháng sinh đã làm ấm để giữ mẫu.
TBT được thu nhận bằng phương pháp chọc hút: Dùng syringe 5ml gắn đầu kim 18G hút 1ml D-PBS, chọc - hút dịch trong các nang có đường kính từ 3-8mm [131]. Sau đó chuyển dịch nang trứng cùng với TBT vào các đĩa Pétri nhựa trống (Φ60) và để lắng từ 5-10 phút trong tủấm 38,5oC (Hình 2.3b, c, d).
Hình 2.3. Các bước thu nhận TBT bò từ buồng trứng
(a) (b)
2.3.2. Đánh giá phân loại tế bào trứng sau khi thu hoạch
TBT được phân loại theo phương pháp của các tác giả Mario Mayes (2002) [99] và De Loos và cs. (1989) [47], gồm 3 loại A, B, C. Loại A - có nhiều hơn 5 lớp tế bào cumulus bao quanh, liên kết chặt chẽ với nhau, bào tương trứng đồng nhất, có thể trông thấy vùng tối ngoại vi; Loại B - còn khoảng 3 lớp tế bào cumulus bao quanh, liên kết chặt chẽ với nhau, bào tương trứng có ít hạt; Loại C - lớp tế bào cumulus hầu như không còn hoặc chỉ còn bao quanh một phần màng trong suốt,