1.5.3.1. Sự giãn nở của tế bào cumulus
Quá trình chín của TBT bò trong ống nghiệm liên quan đến sự phát triển và những thay đổi ở tế bào cumulus bao quanh TBT. Theo Hensleigh và Hunter (1983), các tế bào cumulus phát triển hình thành một khối hình cầu và COC dường như nổi lên trong đĩa nuôi. Các tế bào cumulus được kích thích bởi gonadotrophin (Follicle-stimulating hormone - FSH) và yếu tố tăng trưởng biểu mô (Epidermal Growth Factor - EGF) để tạo ra và bài tiết acid hyaluronic - một chất làm phân rã tế
bào, một quá trình được coi như phát triển giãn nở. Độ giãn nở của tế bào cumulus là một tín hiệu điển hình giúp biết được về mức độ trưởng thành của TBT bò nói chung và TBT các động vật có vú nói riêng [61, 76].
1.5.3.2. Sự trưởng thành của nhân và bào tương trứng
Trong quá trình nuôi chín in vitro TBT bò, cấu trúc nhiễm sắc chất của TBT chưa trưởng thành có nhiều biến đổi. Hiện nay, thời gian nuôi chín in vitro TBT bò khoảng 24 giờ. Với khoảng thời gian này, tỉ lệ đạt đến giai đoạn MII khoảng 80- 90% [61].
Sự trưởng thành về nhân: xuất hiện thêm một thể cực bên trong màng thụ tinh cùng với tế bào lớn bên cạnh [61].
Sự trưởng thành về bào tương trứng: các bào quan được tổng hợp, biến đổi và sắp xếp lại trong suốt quá trình trưởng thành. Bào tương của TBT trưởng thành
đồng nhất, tách màng, đầy đặn và không co lại quá nhiều. Trong khi đó, TBT chưa chín sau 24 giờ IVM không có sự xuất hiện thể cực thứ nhất, bào tương trứng phân rã hoặc không đồng nhất, co lại [61, 76].
TBT chín in vivo và in vitro không có sự khác biệt về sự trưởng thành của nhân, sự thụ tinh và sự phân chia, nhưng có một điều khác biệt rõ nhất là khả năng phát triển phôi vào ngày thứ 4-5 (Hyttel và cs., 1997). TBT trưởng thành in vivo cho tỉ lệ phôi giai đoạn phôi nang cao hơn so với TBT trưởng thành in vitro (Leibfied và cs., 1989). Thực tế cho thấy có khoảng 85% TBT trưởng thành in vivo có thể phát triển thành phôi có khả năng phát triển thành thai, trong khi chỉ khoảng 1/3 số TBT trưởng thành in vitro phát triển thành phôi. Chính sự khác biệt này đã chứng tỏ TBT trưởng thành trong điều kiện in vivo tốt hơn, có đủ năng lực hơn cho quá trình phát triển thành phôi so với nhóm còn lại [61, 72, 76, 86].
1.6. QUÁ TRÌNH THỤ TINH TRONG CƠ THỂ
1.6.1. Khái niệm về thụ tinh
Thụ tinh là một quá trình sinh lí phức tạp, xảy ra giữa TBT (giao tử cái) và tinh trùng (giao tửđực) đã thành thục tại 1/3 phía trên của ống dẫn trứng. Trong quá trình thụ tinh, có sự hợp nhất vật chất di truyền giữa TBT (n) và tế bào tinh trùng (n) để tạo ra hợp tử (2n) mang đặc tính di truyền của cả bố và mẹ [6, 7, 12].
1.6.2. Cơ chế của quá trình thụ tinh
Khi còn ở trong tinh dịch, có một lượng lớn cholesterol bọc quanh đầu tinh trùng (acrosome), do đó làm bền vững màng bao bọc quanh đầu tinh trùng và ngăn chặn sự giải phóng enzyme. Sau khi phóng tinh, tinh trùng di chuyển trong đường sinh dục cái, lớp cholesterol bọc đầu tinh trùng bị mất, màng tinh trùng trở nên yếu và tăng tính thấm đối với Ca++. Nồng độ ion Ca++ trong bào tương của đầu tinh trùng một mặt làm tăng vận động của tinh trùng, mặt khác làm giải phóng các enzyme từđầu tinh trùng qua phản ứng Acrosome [75-77].
Đầu tinh trùng dự trữ một lượng lớn hyaluronidase và các enzyme thủy phân protein. Dưới tác dụng của hyaluronidase, các chất gắn liên kết các tế bào hạt bao quanh TBT bị phá hủy. Sau đó, tinh trùng tiếp tục giải phóng enzyme để phá hủy
màng trong suốt và màng noãn hoàng. Đến lúc này, đầu của tinh trùng đã xâm nhập vào tế bào chất của TBT. Vật chất di truyền của đầu tinh trùng kết hợp với vật chất di truyền của TBT gây ra hiện tượng thụ tinh. Nhân của TBT gọi là tiền nhân cái (n), nhân của tinh trùng gọi là tiền nhân đực (n). Ngay sau đó, màng nhân của tiền nhân cái và của tiền nhân đực mất đi, các nhiễm sắc thể xoắn lại, ngắn và dày lên. Các nhiễm sắc thể này được giải phóng vào bào tương, sắp xếp lại trên mặt phẳng xích đạo cách đều hai cực của TBT, rồi mỗi nhiễm sắc thể con tiến về một cực tế
bào. Trên bề mặt TBT xuất hiện một rãnh phân chia ngày càng rõ [6, 7, 12, 61, 75].
1.6.3. Quá trình phát triển của phôi
Sau khi hợp tử hình thành cùng với sự phát triển và di chuyển đến nơi làm tổ
theo qui định của giống loài, hợp tử bắt đầu phân chia từ một tế bào thành 2, 4, 8, 16 tế bào, phôi dâu, phôi nang.Giai đoạn đầu của quá trình phân chia diễn ra ở ống dẫn trứng, không làm phôi lớn lên về kích thước mà chỉ tăng về số lượng phôi bào. Trong quá trình phân chia, cầu phân chia nhỏ dần, hình thành các đám tế bào có xoang chứa dịch keo to dần lên, lúc này kích thước phôi mới tăng lên, cuối cùng phá vỡ màng trong suốt, phôi chui ra ngoài gọi là phôi nang thoát màng (hatched blastocyst), giai đoạn này tương ứng với ngày thứ 9 đến ngày thứ 11 sau khi thụ
tinh (Hình 1.2) [6, 7, 12, 61, 75].
1.7. THỤ TINH TRONG ỐNG NGHIỆM TỪ NGUỒN TẾ BÀO TRỨNG BÒ
ĐÔNG LẠNH
Quy trình IVF gồm những bước cơ bản: chuẩn bị TBT; chuẩn bị tinh trùng; chuyển TBT vào vi giọt thụ tinh; nuôi hợp tử phát triển thành phôi; cấy truyền phôi tươi hoặc phôi đông lạnh cho con cái nhận phôi. Mỗi bước trong quy trình đều đóng vai trò quan trọng như nhau nhằm đảm bảo khả năng hình thành và phát triển phôi [3, 6, 7, 12].
1.7.1. Chuẩn bị tế bào trứng
Nguồn TBT sử dụng cho IVF có thể thu từ những động vật sống bằng phương pháp gây siêu bài noãn (super ovulation), chọc hút TBT bằng phương pháp siêu âm; từ buồng trứng động vật giết mổ hay sử dụng TBT đông lạnh. Theo Longergan và cs. (1994), các nang trứng có đường kính 2-6 mm hiện diện ở vùng vỏ của buồng trứng được sử dụng cho việc thu nhận các TBT chưa trưởng thành phục vụ cho kỹ
thuật IVF [90]. Trong kỹ thuật IVF, nếu sử dụng các TBT chưa trưởng thành cần có sự hỗ trợ của quá trình nuôi TBT chín. Ngoài ra, sử dụng TBT đông lạnh trong quá trình IVF cũng là một thách thức lớn vì tạo phôi từ nguồn TBT đông lạnh có tỉ lệ
thụ tinh và phát triển phôi không cao; những tổn thương khó phục hồi ở màng nội chất và màng trong suốt của TBT trong quá trình bảo quản [6, 7, 24].
1.7.2. Chuẩn bị tinh trùng
Sự xâm nhập in vitro của tinh trùng vào các TBT đã được thực hiện thành công với tinh tươi hoặc tinh đông lạnh qua giải đông. Việc sử dụng tinh trùng đông lạnh vào kỹ thuật IVF trong phòng thí nghiệm thuận lợi hơn tinh trùng tươi rất nhiều. Có rất nhiều phương pháp để xử lí tinh trùng, việc lựa chọn phương pháp nào là tùy thuộc vào số lượng và chất lượng của tinh trùng. Phương pháp thường được sử dụng để hoạt hóa tinh trùng ở bò là phương pháp bơi lên (swim-up). Phương pháp bơi lên dựa vào khả năng bơi khác nhau của tinh trùng để tách các tinh trùng di động ra khỏi tinh dịch. Phương pháp này chỉ phù hợp cho các mẫu tinh trùng có
khả năng di chuyển tốt. Tinh trùng sau khi xử lí phải đạt mật độ cần thiết để tạo vi giọt thụ tinh [6, 13, 58, 75].
1.7.3. Chuyển tế bào trứng vào vi giọt thụ tinh
Phương pháp IVF phổ biến nhất là đưa TBT vào vi giọt đã được chuẩn bị sẵn có từ 20-50µl huyền phù tinh trùng được phủ lớp dầu khoáng. Ưu điểm của phương pháp này là kiểm soát tối ưu pH và áp suất thẩm thấu môi trường bởi thể tích nhỏ và số lượng tinh trùng ít. Ngược lại, có thể tiến hành cho tinh trùng vào trong môi trường có chứa TBT đã chuẩn bị sẵn trong vi giọt thụ tinh. Sau đó đặt đĩa nuôi vào tủ ấm 38,5oC, 5%CO2, sau 5-6 giờ hút rửa TBT và chuyển sang môi trường nuôi phôi, theo dõi sự phát triển của phôi sau mỗi giai đoạn [58, 75].
Quy trình IVF đòi hỏi nghiêm ngặt về các điều kiện nhiệt độ, độẩm, thời gian thụ tinh, áp suất thẩm thấu của môi trường nuôi cấy. Hầu hết các môi trường IVF cần bổ sung những yếu tố có vai trò hoạt hóa tinh trùng, tăng khả năng hoạt động của chúng. Ngoài ra, cũng bổ sung những yếu tố cần thiết giúp chúng duy trì khả
năng thụ tinh [61].
1.8. SỰ PHÁT TRIỂN CỦA PHÔI TRONG ĐIỀU KIỆN IN VITRO VÀ CÁC NHÂN TỐẢNH HƯỞNG ĐẾN PHÔI IN VITRO NHÂN TỐẢNH HƯỞNG ĐẾN PHÔI IN VITRO
Trong điều kiện in vitro với môi trường chứa dịch muối cân bằng, các cơ chất cung cấp năng lượng, protein, điều kiện môi trường 5%CO2 và ở nhiệt độ 38,5oC, TBT bò sau
khi thụ tinh vẫn có Hình 1.3. Các giai đoạn phát triển của phôi [1]
khả năng phát triển bình thường. Sau khi thụ tinh, phôi phân chia bằng cách nguyên phân liên tục, tạo thành các tế bào phôi. Sự phát triển của phôi tạo ra trong điều kiện
in vitro cũng như phôi in vivo (Hình 1.3) [24].
Có nhiều hệ thống đánh giá phôi sau khi thụ tinh, thường tiêu chuẩn hình thái
được sử dụng để đánh giá chất lượng của phôi bao gồm: số lượng tế bào phôi; kích thước, hình dạng, sựđối xứng, màu sắc bào tương của các tế bào phôi; tỉ lệ xuất hiện các mảnh vỡ tế bào trong bào tương. Hiện nay, các nghiên cứu ở phòng thí nghiệm chủ yếu đánh giá phôi qua hình thái [61].
1.9. MÔI TRƯỜNG DÙNG CHO THỤ TINH TRONG ỐNG NGHIỆM Ở TẾ
BÀO TRỨNG BÒ
Môi trường TALP (Tyrodes Albumin Lactate Pyruvate) sử dụng BSA làm nguồn protein. Năm 1994, Saeki và cs. công bố, các TBT không có COC khi IVF trong môi trường TALP có bổ sung BSA cho tỉ lệ thụ tinh đạt 89% so với 6% ở môi trường TALP không bổ sung BSA [125]. Năm 2000, Pavlok báo cáo, các tế bào hạt có khả năng kéo dài thời gian thụ tinh (fertile lifespan) của tinh trùng bò sau khi bảo quản lạnh/rã đông. Phát hiện này rất hữu ích trong việc cải thiện thụ tinh trong ống nghiệm ở gia súc khi tinh trùng có sức sống thấp [61, 114].
Môi trường dịch ống dẫn trứng tổng hợp (Synthetic Oviductal Fluid - SOF)
được cho là môi trường đơn giản cho việc nuôi phôi của gia súc. Dịch ống dẫn trứng và dịch tử cung của động vật có vú chứa nồng độ cao các acid amin tự do bao gồm alanine, asparagine, glycine, serine và taurine [1, 61]. Acid amin có một vai trò sinh lí của sự phát triển phôi động vật có vú ở giai đoạn trước làm tổ (Gardner và Lane, 1993) [59]. Năm 1991, Fukui và cs. đã báo cáo rằng SOF với 5% oxy và FCS là môi trường tốt nhất để phôi phân chia và phát triển đến giai đoạn phôi nang [56]. Theo Edward và cs. (1997), khi dùng môi trường SOF có acid amin để nuôi phôi bò, có khoảng 50% TBT thụ tinh đã phát triển đến giai đoạn phôi nang chỉ sau 6 ngày nuôi [50]. Năm 1999, Lonergan và cs. đã chứng minh rằng khi nuôi phôi trong môi trường SOF với nồng độ oxy là 5%, có bổ sung cả BSA và FCS đã cải thiện
đáng kể tỉ lệ phát triển của phôi [91]. Lazzari và các cs. (1999) đã báo cáo về việc sử dụng môi trường SOF có bổ sung các acid amin thiết yếu (essential amino acids -
EAA), các acid amin không thiết yếu (non-essential amino acids - NEAA),
glutamine và glycine thu được chất lượng phôi phát triển vào ngày thứ 7 tốt hơn so với môi trường TALP. Nhóm nghiên cứu này cho rằng môi trường SOF không có glucose là môi trường phù hợp cho việc thụ tinh trong ống nghiệm ở gia súc [61].
Hệ thống nuôi cấy không có huyết thanh (Serum-free culture systems) thường dùng nuôi cấy phôi bò. Theo Rosenkrans và First (1991), khi sử dụng môi trường
đơn giản không có huyết thanh, Charles Rosenkrans 1 (CR1), chứa các acid amin thay thế và không thay thế có lợi cho phôi bò phát triển in vitro [123]. Thompson và cs. (1992) đã báo cáo rằng acid amin không thay thế trong môi trường SOF không có huyết thanh đã làm tăng đáng kể phôi nang và số phôi bào, có thể so sánh với phôi phát triển trong môi trường SOF bổ sung albumin huyết thanh người [136]. Năm 1997, Damiani và cs. (ở Mỹ) nhận thấy rằng việc loại bỏ huyết thanh trong giai đoạn phát triển sớm không ảnh hưởng đến sự phát triển của phôi và tỉ lệ mang thai sau khi phôi được cấy truyền [45]. Theo Abe và cs. (1999), việc nuôi trong môi trường không huyết thanh có thể tạo ra một số lượng phôi phù hợp hơn cho việc bảo quản lạnh và cấy truyền phôi [15]. Đến năm 2002, Abe và cs. phát hiện việc nuôi phôi bò trong môi trường không huyết thanh thường tập trung các giọt lipid bất thường trong tế bào chất. Khi lượng lipid quá mức có ảnh hưởng đến việc bảo quản phôi. Họ cũng phát hiện ra các giọt lipid khi nuôi trong môi trường có huyết thanh lớn hơn nhiều so với trong môi trường không có huyết thanh (2-6µm so với < 2µm, tương ứng) [14]. Nhìn chung, phôi của động vật có vú tạo ra trong ống nghiệm có thể phát triển đến giai đoạn phôi dâu/phôi nang trong các môi trường có thành phần hóa học xác định mà không bổ sung thêm bất kỳ loại huyết thanh nào hay các yếu tố
có từ tế bào ống dẫn trứng [1, 61, 76].
Môi trường BO (Brackett-Oliphant) được xem là môi trường cơ bản dùng để
CR1aa để nuôi phôi. Trong những năm gần đây, một số nhà khoa học đã sử dụng môi trường BO làm môi trường thụ tinh, và môi trường CR1aa để nuôi phôi. Họđã thu được tỉ lệ thụ tinh khá cao đạt 50,67% ở TBT tươi (Nguyễn Văn Lý, 2006), 48,83% (Phan Kim Ngọc và cs., 2009), 73% (Prentice, 2010). Tỉ lệ phôi phát triển
đến giai đoạn phôi nang đạt 30,12% (Nguyễn Văn Lý, 2006), 18,01% (Phan Kim Ngọc và cs., 2009), 22% (Prentice 2010) [5, 8, 118].
Môi trường đồng nuôi cấy với tế bào ống dẫn trứng bò (Co-culture with bovine oviductal cells) đã khắc phục được sự phát triển của phôi vượt qua giai đoạn 8-16 tế bào. Tuy nhiên, môi trường đồng nuôi cấy cho kết quả vẫn thấp hơn so với trong cơ thể. Rief và cs. (2002) đã dùng hệ thống nuôi cấy cơ bản bởi lớp đơn BOEC (Bovine Oviduct Epithelial Cell - tế bào biểu mô ống dẫn trứng bò) trong môi trường SOF bổ sung 5% huyết thanh bò động dục (oestrous cow serum - OCS), nhóm này nhận thấy môi trường này có lợi cho việc thiết lập nên một mô hình trong
ống nghiệm để nghiên cứu sự phát triển của phôi ở giai đoạn sớm: như sự trao đổi chất và năng lượng của các gen được chọn lựa về khả năng phát triển [121]. Xia và cs. (1995) nhận thấy cách nuôi cấy với lớp đơn ống dẫn trứng có thể hỗ trợ sự phát triển phôi bò giai đoạn sớm, nhưng để duy trì tỉ lệ phát triển đến giai đoạn phôi nang cao thì cứ mỗi 2-3 ngày phải được thay sạch môi trường nuôi cấy [149]. Applewhite và Westhusin (1995), báo cáo rằng có nhiều phôi phát triển đến giai
đoạn phôi dâu/nang hơn khi bổ sung tế bào BOEC vào môi trường nuôi cấy [26]. Mishra và cs. (1999) cho rằng BOEC chứa thụ thể LH - có chức năng làm gia tăng sự tổng hợp glycoprotein của ống dẫn trứng, chính yếu tố này làm tăng sự phát triển giai đoạn sớm của phôi lên giai đoạn phôi nang [102]. Tavares và cs. (2000) tiến hành nuôi cấy các hợp tử trong môi trường TCM-199 bổ sung các tế bào ống dẫn trứng bò hoặc các tế bào hạt, kết quả chưa thấy có sự khác biệt về tỉ lệ phôi nang giữa các môi trường [134]. Việc đồng nuôi cấy với các tế bào ống dẫn trứng đã làm tăng tỉ lệ phát triển của phôi in vitro của gia súc ở giai đoạn đầu. Tuy nhiên, cơ chế
tác động của các tế bào ống dẫn trứng trong quá trình nuôi vẫn chưa rõ. Người ta
lượng đặc biệt giúp cho sự phát triển của phôi. Hiện nay vẫn còn nhiều nghiên cứu về cơ chế tác động của các tế bào ống dẫn trứng lên sự phát triển của phôi gia súc