Bảng 3.8. Kết quả IVF từ TBT MII đông lạnh ở hai lô thí nghiệm
Lô
Số TBT
đem thụ
tinh
Tỉ lệ các giai đoạn phát triển của phôi (%)
Phôi 2 TB Phôi 8-16 TB Phôi dâu Phôi nang
TN1 781 12,93 ± 1,2 a (101) 11,01 ± 1,12a (86) 5,76 ± 0,83a (45) 3,71 ± 0,68a (29) TN2 578 23,18 ± 1,76 b (134) 14,71 ± 1,47b (85) 7,44 ± 1,09a (43) 5,71 ± 0,97a (33)
a, b: khác nhau theo cột, có ý nghĩa thống kê ởđộ tin cậy 95%
TN1- đông lạnh theo quy trình 1; TN2 - đông lạnh theo quy trình 3 (có Taxol) Kết quả Bảng 3.8 cho thấy: tỉ lệ thụ tinh ở lô TN2 cao gấp 1,79 lần so với lô TN1 (23,18% so với 12,93%, P < 0,001); tỉ lệ phát triển phôi ở giai đoạn 8-16 tế
bào ở lô TN2 cao gấp 1,33 lần so với lô TN1 (11,01% so với 14,71%, P < 0,05); tỉ
lệ phôi dâu ở hai lô thí nghiệm không khác biệt về mặt thống kê (5,76% so với 7,44%, P > 0,05; tương ứng). Riêng tỉ lệ phôi nang ở hai lô thí nghiệm cho thấy
không khác biệt về mặt thống kê với α = 0,05 (3,71% so với 5,71%, P = 0,081), nhưng có sự khác biệt với độ tin cậy 91,9%. Cụ thể, tỉ lệ phôi nang trong TN2 cao gấp 1,54 lần so với tỉ lệ phôi nang trong TN1 (độ tin cậy 91,9%). Như vậy, những TBT được xử lí trước với 1µM Taxol kết hợp 5% FCS có xu hướng cho tỉ lệ thụ
tinh và phát triển đến giai đoạn phôi nang cao hơn hẳn so với nhóm chưa được xử lí với Taxol kết hợp 5% FCS.
BÀN LUẬN
Theo Checura và cs. 2007 [40] và George (1992) [60], các đại phân tử có trong FCS có khả năng ngăn cản sự xơ cứng màng trong suốt. Checura và cs. khi sử
dụng FCS bổ sung vào dung dịch thủy tinh hóa TBT bò MII với nồng độ 20% đã cho tỉ lệ thụ tinh 77,3% (84/109), có 62,3% (67 phôi) đạt đến giai đoạn phôi 8 tế
bào, và 17,6% (19 phôi) phát triển đến giai đoạn phôi nang. Trong TN2 của chúng tôi có sử dụng 10% FBS và 5% FCS bổ sung vào môi trường thủy tinh hóa, trong khi ở TN1 chỉ có 10% FBS. Ngoài ra, trong TN2 có bổ sung 1µM Taxol vào môi trường thủy tinh hóa. Như vậy, ngoài vai trò của Taxol (đã trình bày 3.3.2) thì có thể FCS cũng có ảnh hưởng đến kết quả thụ tinh. Trong thí nghiệm của chúng tôi, TBT được chọn để thủy tinh hóa không được loại bỏ cumulus hoàn toàn, mà chỉ
loại bỏ một phần bằng pipette. Checura (2007) cũng chỉ loại bỏ một phần cumulus bằng hyaluronidase (100U/ml) [40]. Lợi ích của tế bào cumulus đối với việc bảo quản lạnh TBT MII hiện nay còn đang tranh luận. Một số tác giả cho rằng, sự hiện diện của tế bào cumulus rất có lợi, chúng bảo vệ TBT chống lại sốc thẩm thấu - đây là nguyên nhân làm cho cấu trúc màng trở nên cứng và tổn thương về hình thái. Chẳng hạn như, sự hiện diện của tế bào cumulus làm gia tăng tỉ lệ phân chia của phôi hơn so với các TBT bị loại bỏ hoàn toàn cumulus (Fatehi và cs., 2002 [53]); ở
1991 [153]; Zhang và cs., 1995 [155]; Fatehi và cs., 2002 [53]). Ngược lại, cũng có ý kiến cho rằng, sự có mặt của tế bào cumulus gây cản trở sự xâm nhập của các chất bảo vệ lạnh và thay đổi quá trình đông lạnh [155]. Như vậy, việc loại bỏ tế bào cumulus trong thí nghiệm này ít nhiều cũng ảnh hưởng đến kết quả phát triển về sau.
Một điểm chính của tất cả các quy trình bảo quản TBT hiện nay là khả năng phát triển về sau của TBT có thể bị tổn thương, những vấn đề này hầu hết đã được chứng minh ở TBT người và TBT bò (Bernard và Fuller, 1996 [33]; Vajta, 2000 [137]). Trong những thí nghiệm gần đây, trên 90% TBT bò hoặc bê sống sau khi giải đông theo đánh giá hình thái. Do đó, các ảnh hưởng bất lợi của quá trình bảo quản lạnh dần dần trở thành hiển nhiên trong suốt quá trình nuôi in vitro. Cơ chế
thoái hóa bắt đầu từ những TBT không phân chia. Trong số những phôi bò phân chia, chỉ khoảng 3% có thể phát triển đến giai đoạn phôi nang từ các TBT bê được thủy tinh hóa. Phần lớn các TBT bị ngừng phát triển trong suốt những ngày đầu nuôi cấy và trải qua thoái hóa. Hiện nay, các TBT khi trải qua bảo quản lạnh được thụ tinh và được nuôi cấy in vitro đến giai đoạn phôi nang cũng sử dụng quy trình tương tự như các TBT tươi (không qua bảo quản lạnh). Đây là những lí do để tin chắc rằng các TBT xử lí khác nhau được nghiên cứu trong suốt quá trình bảo quản lạnh có thể có những ảnh hưởng xấu. Chính những tác động xấu này làm giảm sức chịu trong các hệ thống nuôi cấy in vitro. Năm 2003, Men và cs. đã báo cáo về cơ
chế thoái hóa ở các TBT được bảo quản lạnh là apoptosis (chết theo chương trình) [100]. Sựức chế của apoptosis trong suốt quá trình bảo quản lạnh và việc nuôi cấy sau đó hoặc sự kích thích khả năng tạo phân bào có thể cải thiện trong quá trình bảo quản lạnh TBT động vật có vú [100].
Những phát hiện ngày nay chứng minh rằng việc xử lí trước với Taxol giữ được tính ổn định về hình dạng thoi vô sắc ở TBT bê, thúc đẩy sự di chuyển các hạt vỏ và phân chia phôi sớm ở cả TBT bò và bê khi được bảo quản bằng phương pháp thủy tinh hóa bởi cọng rạ [103]. Kết quả của chúng tôi đã thành công khi bảo quản TBT bò MII bằng phương pháp thủy tinh hóa được xử lí trước với Taxol. Tuy nhiên,
cần khảo sát sựđáp ứng của TBT ở các nồng độ Taxol khác nhau nhằm tìm ra nồng
độ tối ưu khi bổ sung vào dung dịch bảo vệ.