Đây là những chất không có khả năng thấm qua màng tế bào (non-permeable CPA). Chúng kết hợp vào dung dịch thủy tinh hóa giúp loại nước ra khỏi tế bào nhanh hơn và giảm bớt thời gian tế bào tiếp xúc với những chất bảo vệ gây độc. Các chất này thường có phân tử lượng lớn: protein (Bovine Serum Albumin - BSA, Fetal Bovine Serum - FBS), saccharide, disaccharide (sucrose, trehalose, lactose), trisaccharide (raffinose), các polymer (polyvinylpyrrolidone - PVP, polyethylene glycol ) [12, 61].
Sucrose là một chất đệm thấm chọn lọc để giảm bớt sốc thẩm thấu, giúp đẩy nước ra khỏi tế bào. Nó làm giảm thời gian tế bào tiếp xúc với chất bảo vệ lạnh có tính độc, hạn chế sốc thẩm thấu. Người ta đã chứng minh được nồng độ sucrose cao (ví dụ 1mol/lít) thực sự không gây độc cho phôi và TBT [55].
Trehalose được xem là chất bảo vệ rất tốt cho phương pháp đông lạnh cực nhanh đối với TBT. Điều này được khẳng định qua các thử nghiệm của nhiều nhóm tác giả khác nhau (Dinnyes và cs., 2000 [49]; Lj và cs., 2002 [88]; Begin và cs., 2003 [31]). Năm 1993, Arav và cs., đã báo cáo rằng TBT bò tiếp xúc với trehalose trong quá trình đông lạnh có tỉ lệ sống cao hơn so với tiếp xúc với sucrose và tỉ lệ
thụ tinh rất cao (70%) khi tiếp xúc với dung dịch bảo vệ có 0,25M trehalose [27]. Cả sucrose và trehalose ngăn chặn màng tế bào bị biến đổi bởi nhiệt độ, ổn định độ
bền của enzyme và màng tế bào, cải thiện hoạt tính của các kênh vận chuyển ion, giúp tạo dạng thủy tinh bền vững [92].
Việc bổ sung đường vào môi trường cơ bản dùng EG làm chất chống đông có thể ảnh hưởng mạnh đến các đặc tính thủy tinh hóa của dung dịch. Công việc này hỗ trợ sự ổn định cấu trúc màng [80]. Các disacchride hoạt động như các hệ đệm thẩm thấu, làm giảm sốc thẩm thấu và độc tính của EG. Muốn sự bảo quản lạnh thành công phải giảm nồng độđường cần thiết [61].
Trong quá trình thủy tinh hóa, các polymer không thấm có trọng lượng phân tử thấp hay các đại phân tử thường được dùng để làm giảm thiểu lượng CPA cần thiết vào trong tế bào, đồng thời làm giảm tính độc hại của dung dịch. Các polymer này bảo vệ màng trong suốt, tránh cho chúng bị đứt gãy (cracking) [115]. Phần lớn, các dung dịch được dùng để thủy tinh hóa TBT chứa phức hợp đại phân tử của huyết thanh bê (Calf Serum - CS) hay albumin huyết thanh bò (Bovine serum albumin - BSA). Các đại phân tử khác dùng trong dung dịch thủy tinh hóa gồm polyethylene glycol, polyvinylpyrrolidone, Ficoll và polyvinyl alcohol [115]. Việc bổ sung các polymer không thấm cần kết hợp các CPA. Sự tiếp xúc từng bước của các CPA đã giảm thiểu ảnh hưởng của độc tính của chất bảo quản lạnh lên tế bào. Việc chuyển các tế bào vào dung dịch có nồng độ EG thấp hơn trước khi chuyển chúng sang hỗn hợp disaccharid có nồng độ EG cao hơn có thể làm giảm ảnh hưởng của độc tính lên CPA [115].