Dùng mouth pipette thu những TBT loại A và B (có từ 3 lớp cumulus trở lên) từđĩa D-PBS cho vào các giếng có môi trường rửa tương ứng với các lô thí nghiệm: lô 1 - IVF Flushing; lô 2 và lô 3 - DPBS (500 l/giếng và phủ 1ml dầu khoáng),rửa 3-5 lần, rồi chuyển sang đĩa chứa môi trường nuôi (IVM1 = TCM-199 + 10% FBS +
10ng EGF + 0,2mM Natri pyruvate + 50µg/ml Gentamicin, IVM2 = TCM-199 +
10% FBS + 5% FCS + 10ng EGF + 0,2mM Natri pyruvate + 50µg/ml Gentamycin,
IVM3 = TCM-199 + 10% FBS + 5% FCS + 10IU/ml hCG + 10ng EGF + 0,2mM
Natri pyruvate + 50µg/ml Gentamycin, tương ứng với từng lô thí nghiệm)để rửa sạch. Sau cùng chuyển 20 phức hợp COC (phức hợp trứng và cumulus) vào giếng
nuôi chứa môi trường nuôi cấy để nuôi TBT tương ứng với từng lô thí nghiệm: IVM1, IVM2, IVM3 (loại đĩa 4 giếng chứa 100 l/giếng có phủ 1 ml dầu khoáng để
ngăn chặn vi sinh vật xâm nhập vào môi trường nuôi cấy và đảm bảo thể tích của giọt cấy được ổn định trong suốt thời gian nuôi (Hình 2.5)). Nuôi TBT trong tủấm
ởđiều kiện 38,5oC, 5% CO2, hơi nước bão hòa.
Hình 2.5. Đĩa chứa môi trường IVM tế bào trứng
Sau 22-24 giờ nuôi cấy, đánh giá sự chín của TBT dưới kính hiển vi đảo ngược theo độ giãn nở và màu sắc của các lớp tế bào cumulus, sự đồng đều của tế
bào chất.
TBT chín: tế bào chất đồng đều, màu sáng; các tế bào cumulus giãn nở rộng và đều;
TBT chưa chín: tế bào chất đồng đều, màu sáng; các tế bào cumulus chưa giãn nở rộng;
TBT chết: Tế bào chất co lại hoặc phân mảnh nhiều, các tế bào cumulus rời rạc hoặc không còn bám xung quanh TBT.
Những TBT được cho là chín theo độ giãn nở cumulus và tế bào chất sáng
đều, được chuyển sang các vi giọt môi trường nuôi tương ứng từng lô thí nghiệm để đông lạnh hoặc thụ tinh (làm đối chứng cho thí nghiệm IVF).
Trong số các TBT thu được, lấy ngẫu nhiên một phần để xác định sự chín bằng cách tách bỏ lớp cumulus bởi mouth pipette và 0,1% hyaluronidase trong môi
trường nuôi cấy. Những TBT có sự xuất hiện của thể cực thứ nhất được ghi nhận là TBT đã chín, những TBT này sau đó bị loại.