quy trình 3
Bảng 3.6. Kết quả IVF từ nguồn TBT MII đông lạnh theo QT2 và QT3
Lô
Số TBT
đem thụ
tinh
Tỉ lệ (%) các giai đoạn phát triển của phôi
Phôi 2 TB Phôi 8-16 TB Phôi dâu Phôi nang
TN2 578 23,18 ± 1,76 a (134) 14,71 ± 1,47a (85) 7,44 ± 1,09a (43) 5,71 ± 0,97a (33) ĐC2 528 14,58 ± 1,54 b (77) 12,69 ± 1,45a (67) 4,92 ± 0,94a (26) 3,79 ± 0,83a (20) ĐC2’ 183 55,74 ± 3,67 c (102) 47,54 ± 3,69b (87) 35,52 ± 3,54b (65) 26,78 ± 3,27b (49)
a, b, c: khác nhau theo cột, có ý nghĩa thống kê ởđộ tin cậy 95%
TN2 - đông lạnh theo QT3 (có Taxol); ĐC2 - đông lạnh theo QT2 (không có Taxol); ĐC2’- TBT tươi
Tiến hành thụ tinh cho 578 TBT MII sau khi giải đông (theo quy trình 3) qua 6
đợt lặp lại, chỉ có 134 TBT thụ tinh (phôi 2 tế bào), đạt tỉ lệ23,18 ± 1,76%. Trong khi đó, ở những TBT được đông lạnh theo quy trình 2, có 77/528 TBT thụ tinh, đạt tỉ lệ 14,58 ± 1,54%; còn ở lô đối chứng (không qua đông lạnh), tỉ lệ thụ tinh đạt 55,74 ± 3,67%. Tỉ lệ phôi phát triển đến giai đoạn 8-16 tế bào, phôi dâu, phôi nang
ở lô TN2 (có bổ sung Taxol) lần lượt là 14,71%; 7,44% và 5,71%. Ở lô ĐC2 (đông lạnh không bổ sung Taxol) và ĐC2’ (TBT chưa qua đông lạnh), tỉ lệ này lần lượt là 12,69%; 4,92%; 3,79% và 47,54%; 35,52%; 26,78%, tương ứng.
Xét sự chuyển tiếp của phôi từ giai đoạn phôi 8-16 tế bào lên phôi dâu và từ
phôi dâu lên phôi nang ở từng lô, kết quả thể hiện ở Bảng 3.7.
Bảng 3.7. So sánh sự chuyển tiếp của phôi ở các giai đoạn liền kề
Lô Tỉ lệ chuyển tiếp của phôi (%) Chỉ số P theo hàng Phôi 2 tế bào lên phôi 8-16 tế bào Phôi 8-16 tế
bào lên phôi dâu
Phôi dâu lên phôi nang TN2 63,43 ± 4,16 (85/134 phôi) 50,59 ± 5,42 (43/85 phôi) 76,74 ± 6,44 (33/43 phôi) 0,0129
ĐC2 87,01 ± 3,83 (67/77 phôi) 38,81 ± 5,95 (26/67 phôi) 76,92 ± 8,26 (20/26 phôi) 3.642e-09
ĐC2’ (87/102 phôi) 85,29 ± 3,51 74,71 ± 4,66 (65/87 phôi) 75,38 ± 5,34 (49/65 phôi) 0,1403
Chỉ số P theo
cột 1,888e-
05 2,443e-05 0,9813
Ở thí nghiệm bổ sung Taxol, 63,43% phôi từ giai đoạn 2 tế bào chuyển tiếp lên phôi 8-16 tế bào, có 50,59% phôi từ giai đoạn 8-16 tế bào chuyển tiếp lên phôi dâu và 76,74% phôi dâu phát triển lên phôi nang, tỉ lệ chuyển tiếp của phôi ở ba mốc giai đoạn này có sự khác biệt về mặt thống kê (P < 0,05). Ở thí nghiệm không được bổ sung Taxol, tỉ lệ chuyển tiếp từ giai đoạn phôi 2 tế bào lên phôi 8-16 tế bào đạt tới 87,01%, tỉ lệ chuyển tiếp từ giai đoạn phôi 8-16 tế bào lên phôi dâu chỉ đạt 38,81% và 76,92% phôi dâu phát triển lên giai đoạn phôi nang (P < 0,001). Riêng ở
đang xét rất cao (85,29%; 75,68% và 74,11%, tương ứng), nhưng sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê (P > 0,05).
Khi so sánh theo cột, giữa lô có bổ sung Taxol và không bổ sung Taxol, tỉ lệ
chuyển tiếp của giai đoạn phôi 2 tế bào lên phôi 8-16 tế bào khác biệt nhau rất có ý nghĩa (63,43% so với 87,01%; P < 0,001), nhưng từ 8-16 tế bào lên phôi dâu và từ
phôi dâu lên phôi nang sự khác biệt nhau không có ý nghĩa (50,59% so với 38,81%; 76,74% so với 76,92%; P > 0,05), nhưng cả ba tỉ lệ này cách biệt rất có ý nghĩa thống kê so với lô đối chứng không trải qua bảo quản lạnh (P < 0,001). Kết quả này cho thấy phôi chủ yếu bị “block” ở giai đoạn 8-16 tế bào, khi vượt qua được giai
đoạn này, tỉ lệ phát triển đến giai đoạn phôi nang cao hơn (76,74%; 76,92% và 75,38%, tương ứng).
BÀN LUẬN
Kết quả ở Bảng 3.6 cho thấy tỉ lệ thụ tinh đối với các TBT được xử lí trước với Taxol đã cải thiện đáng kể so với các TBT không được xử lí trước với Taxol (23,18% so với 14,58%, P < 0,001). Tức là các TBT MII được bảo quản lạnh trong môi trường có bổ sung Taxol cho tỉ lệ thụ tinh gấp 1,59 lần so với các TBT MII bảo quản lạnh trong môi trường không được bổ sung Taxol. Tuy nhiên các tỉ lệ này vẫn thấp hơn so với lô ĐC2’ - các TBT không qua bảo quản lạnh (55,74%, P < 0,001). Như vậy, nhóm TBT được xử lí trước với Taxol trước khi bảo quản bằng phương pháp thủy tinh hóa đã được cải tiến về tỉ lệ thụ tinh. Chính điều này cũng làm cho tỉ
lệ phát triển các giai đoạn tiếp theo của phôi (8-16 tế bào, phôi dâu, phôi nang) tăng lên, và cao hơn so với nhóm TBT không được xử lí trước với Taxol (14,71% so với 12,69%; 7,44% so với 4,92%; 5,71% so với 3,79%, tương ứng), sự khác biệt này không có ý nghĩa thống kê ở độ tin cậy 95% (P > 0,05). Tuy nhiên, tỉ lệ chuyển tiếp của phôi 2 tế bào lên phôi 8-16 tế bào ở TN2 thấp hơn ĐC2 (63,43% so với 87,01%; P < 0,001), nhưng tỉ lệ chuyển tiếp từ phôi 8-16 tế bào lên phôi dâu ở TN2 lại cao hơn ĐC2, có ý nghĩa thống kê ởđộ tin cậy 86% (50,59% so với 38,81%). Tỉ lệ phôi dâu ở TN2 cao hơn ĐC2 với độ tin cậy 91,6%; tỉ lệ phôi nang ở TN2 cao hơn ĐC2
với độ tin cậy 86,5% (xem phụ lục 3, phần 3.2.2.2). Tất nhiên, tỉ lệ này ở cả hai nhóm TBT (xử lí và không xử lí trước với Taxol) đều thấp hơn so với nhóm TBT chưa qua đông lạnh (47,54%; 35,52% và 26,78%, tương ứng, P < 0,001). Như vậy, Taxol có xu hướng giúp tăng tỉ lệ thụ tinh, tỉ lệ chuyển tiếp từ phôi 8-16 tế bào lên phôi dâu, nhưng lại làm giảm tỉ lệ chuyển tiếp từ phôi 2 tế bào lên phôi 8-16 tế bào.
Theo Albarracin và cs. (2005), tốc độ làm lạnh không chỉ là nhân tố chính làm
ảnh hưởng đến sự phân bào và làm tổn thương thoi vô sắc mà còn ảnh hưởng đến khả năng sống của TBT sau khi thủy tinh hóa [20]. Một số nghiên cứu đã mô tả về
khả năng bảo quản tính toàn vẹn của thoi vô sắc đối với TBT động vật có vú khi
được làm lạnh (Eroglu và cs., 1998) [52]. Các dao động về nhiệt độảnh hưởng trực tiếp đến sự tổ chức bộ khung tế bào và NST của TBT bò giai đoạn MII (Aman và Parks, 1994 [23]; Saunders và Parks, 1999 [127]) và TBT người (Almeida và Bolton, 1995 [22]; Boiso và cs., 2002 [37]).
Các kết quả của chúng tôi đạt được phù hợp với những báo cáo của Park và cs. (2001) [111] về việc bổ sung Taxol vào dung dịch thủy tinh hóa bảo quản TBT chuột, cải thiện sự phát triển của phôi ở giai đoạn tiền làm tổ; Fuchinoue và cs. (2004) [54] đã chứng minh rằng việc sử dụng Taxol có thể cải thiện được sự phát triển của phôi từ những TBT người đông lạnh/giải đông; đồng thời họ cũng quan sát thấy phôi phát triển đến giai đoạn phôi nang. Theo Schmidt và cs. (2004) [128], tỉ lệ
phân chia của phôi tạo ra từ các TBT bò MII bảo quản lạnh bằng phương pháp thủy tinh hóa trong các vi giọt chứa Taxol chia cao hơn (đạt khoảng 20%). Năm 2006, Shi và cs. đưa đến kết luận: việc xử lí trước với Taxol làm giảm những tổn thương về tổ chức thoi vô sắc phân bào trong quá trình thủy tinh hóa, do đó nâng cao sự
phát triển của TBT heo sau khi thủy tinh hóa. Morato và cs., 2008a [103] đã tiến hành xử lí TBT bò và bê trước khi thủy tinh hóa với Taxol. Kết quả thu được tỉ lệ
thụ tinh ở TBT bò và bê lần lượt là 41,19% và 33,7%, còn ở lô TBT chưa qua đông lạnh là 78,3% và 69,8%, tương ứng. Ở TBT bê chưa có phôi nào phát triển đến giai
vậy, kết quả của Morato và cs. đã thu được ở nhóm xử lí với Taxol cho kết quả tốt hơn so với nhóm không xử lí với Taxol đối với TBT bò.
Kết quả nghiên cứu của chúng tôi thu được tỉ lệ thụ tinh thấp hơn so với nghiên cứu của Morato và cs. (2008a), nhưng tỉ lệ phát triển đến giai đoạn phôi nang lại cao hơn (23,15% so với 41,19%; và 5,72% so với 3,2%, tương ứng) [103]. Tuy nhiên, tỉ lệ phát triển đến phôi nang vẫn còn thấp hơn nhiều so với các công bố
gần đây: Checura và Siedel (2007): 8,7% [40]; Sripunya và cs. (2010): 8,7% (dùng vật mang là cryotop) và 9,8% (dùng vật mang là bề mặt chất rắn) [133]. Các nghiên cứu trước đây đều cho rằng TBT MII khó bảo quản lạnh hơn phôi do thoi vô sắc ở
kì giữa có độ nhạy với nhiệt độ, dễ gây tổn thương lạnh [129, 133]. Khi xử lí TBT MII với chất bảo vệ lạnh hay đem đông lạnh đều có thể gây ra những phản ứng sinh hóa làm xơ cứng màng trong suốt. Chính điều này là một nhân tố làm giảm tỉ lệ thụ
tinh và phát triển về sau của phôi.
Trong thí nghiệm của chúng tôi, ở quy trình giải đông, sau khi thực hiện qua 3 bước giải đông, chúng tôi có để các TBT này vào môi trường nuôi có bổ sung 10% dung dịch acid Tyrode trong 20 giây. Theo Mansour và cs. (2000), dùng dung dịch acid Tyrode đậm đặc để loại bỏ màng trong suốt phôi người trong vài giây [93]; Balaban và cs. (2002), khi sử dụng dung dịch acid Tyrode đậm đặc với thể tích 30µl có thể khoan màng trong suốt của TBT người trong 60 giây giúp hỗ trợ thoát màng [29]; Gordon và cs. (2003), có thể dùng dung dịch acid Tyrode để khoan màng TBT chuột giúp nâng cao tỉ lệ thụ tinh [61]. Fan và cs. (2009), dùng dung dịch acid Tyrode đậm đặc (pH 3,1) để loại bỏ ZP ở TBT chuột sau khi thủy tinh hóa trong khoảng thời gian từ 60 giây, vẫn có thể thực hiện IVF với tinh trùng đông lạnh [156]. El-Mestrah và cs. (2002), chứng minh rằng ZP1, ZP2 VÀ ZP3 phân bố trong toàn bộ độ dày của ZP. Do đó, nếu lớp ngoài của ZP bị loại bỏ bởi dung dịch acid Tyrode, thì các glycoprotein còn tồn lưu của ZP có thể tương tác với tinh trùng [51]. Một số nghiên cứu cho rằng màng trong suốt của TBT sau khi đông lạnh có hiện tượng cứng lại (zona hardening) [62, 83], trong khi dung dịch acid Tyrode có tính
chất làm tan màng trong suốt và thường được sử dụng để phá màng trong quá trình cắt phôi, sinh thiết phôi. Bản chất của dung dịch này là loại bỏ màng trong suốt trong thời gian rất ngắn (30-60 giây) khi ở nồng đậm đặc. Chính vì vậy, chúng tôi tiến hành bổ sung dung dịch acid Tyrode vào môi trường nuôi TBT sau giải đông với nồng độ thấp (10%), thời gian tiếp xúc rút ngắn so với nồng độ nguyên chất (20 giây). Đây là một khảo sát thăm dò nồng độ và thời gian tiếp xúc với dung dịch này nhằm giúp màng trong suốt bớt tính cứng sau khi bảo quản lạnh. Từđó giúp tăng tỉ
lệ thụ tinh và phát triển về sau của phôi. Kết quả cho thấy tỉ lệ phát triển đến giai
đoạn phôi nang đã cải thiện rõ rệt.
Cho đến thời điểm này, ở nước ta vẫn chưa có công trình nào công bố về kết quả IVF TBT bò giai đoạn MII thủy tinh hóa được xử lí trước với Taxol và sau giải đông có xử lí nhanh với dung dịch acid Tyrode. Như vậy, kết quảđạt được cho thấy
đã có thể tạo phôi bò từ nguồn TBT đông lạnh bằng phương pháp thủy tinh hóa. Tuy nhiên, cần có những nghiên cứu sâu hơn về cấu trúc bên trong cũng như các quy trình thủy tinh hóa khác để nâng cao tỉ lệ thụ tinh và tỉ lệ phát triển của phôi.